Extracción de ADN de hojas de guayacán

Extracción, cuantificación y evaluación de calidad de ADN de hojas secas de Guayacán (Handroanthus chrysanthus)

Pardo S., Pardo A., Peña D., Platt M. & Riofrío L.

RESUMEN

El uso de tejido o muestra apropiado y de protocolos adecuados para la extracción de ADN son puntos críticos en estudios de biología molecular. En la presente práctica se realizó la extracción, cuantificación y evaluación de la calidad de la molécula a partir de hojas secas de la especie vegetal Handroanthus chrysanthus, previamente secadas y conservadas en sílica gel. Para la extracción del ADN se ocupó el DNeasy Plant Mini Kit de QIAGEN® utilizado para plantas y hongos; se realizó dos tratamientos,  diferenciándose en el peso de la muestra y  en la aplicación y no aplicación de la enzima RNasa. Las muestras fueron cuantificadas con el NanoDrop de Thermo Scientific® y verificadas a través de electroforesis. Los resultados obtenidos muestran que la aplicación de RNasa es clave para en la extracción del ADN pues influyó en la cantidad, pureza e integridad de la molécula; además, se arrojó valores elevados para el rango de 260/230, lo que podría indicar una posible contaminación de la muestra por polifenoles, ARN y polisacáridos, por lo tanto es necesario utilizar un Kit específico al tipo de muestra y especie vegetal.

1. INTRODUCCIÓN

La obtención y aislamiento de ADN puro e intacto es clave en la aplicación y desarrollo de técnicas de biología molecular (Sahu, S. K., Thangaraj, M., & Kathiresan, K, 2012), es por ello que la extracción correcta de ADN, que es un proceso utilizado para aislar esta molécula partiendo de muestras biológicas, es tan necesaria (Lee & Shewale, 2006). Está dado en dos momentos: uno de lisis caracterizado por el rompimiento de estructuras que envuelven al ADN y otro de purificación que involucra la limpieza de gran parte de elementos que impidan obtener un ADN más puro (Microbial S.L, 2009).

La necesidad de poseer muestras limpias y de calidad generó la invención de nuevos protocolos que aseguren una correcta manipulación y depuración de inhibidores que perjudiquen los tratamientos siguientes a los que se someterá la molécula (Patricia, Velázquez, Aragón, & Romero, 2008). El uso de métodos tradicionales nos permite conseguir un bajo costo en materiales y un alto rendimiento en la calidad de la muestra, obteniendo una molécula fragmentada, pura y libre de contaminación (Störmer, Kleesiek, & Dreier, 2007); sin embargo, no es aplicable para todo tipo de muestra.

Actualmente, el uso de protocolos estándares, métodos comerciales y kits de extracción, nos ha permitido aislar selectivamente el ADN sin rupturas (Patricia et al., 2008). Para asegurar el buen funcionamiento de un kit, la selección tanto del tipo de tejido y la cantidad de la muestra inicial es crucial. Entre los inconvenientes presentados por trabajar con muestras vegetales se encuentra la constitución de la pared celular, la cual deberá ser rota mediante la implementación de fuerzas mecánicas o pulverizando el tejido (Mosquera Velasco, 2005) (Patricia et al., 2008). Otro punto a considerar dentro de este tipo de muestras es que muchas especies vegetales poseen en sus células moléculas de polisacáridos y polifenoles los cuales no son eliminados si no se aplica un kit en particular (Dhaliwal, 2013).

Una vez extraído el ADN se procede a realizar una electroforesis la cual nos permite que las moléculas se separen hacia los polos según su carga, permitiéndonos así el análisis y caracterización de los ácidos nucleicos de cualquier procedencia (Padilla, Diez, Martínez, Bárcena & García, 2006). Bajo estas premisas, la presente práctica posee como objetivo lograr una correcta extracción y cuantificación de ADN a partir de muestras vegetales (Handroanthus chrysanthus) y su posterior análisis por medio de electroforesis en gel de agarosa.

1. MATERIALES Y MÉTODOS

Extracción del ADN

En el desarrollo de la siguiente práctica se utilizó material vegetal previamente secado de la especie Handroanthus chrysanthus. Para la extracción de ADN se empleó el kit DNeasy Plant Mini Kit de QIAGEN® utilizado para plantas y hongos, siguiendo su protocolo.

Primero en 2 tubos Eppendorf, con la ayuda de una balanza de precisión se pesó 10.2 mg y 17.7 mg de H. chrysanthus, etiquetando G4. 1 y G 4. 2 respectivamente a los tubos. Luego, con una bola de tungsteno en cada uno, se ubicaron en un molino de trituración por 2 minutos para pulverizar las muestras. Para empezar con el proceso de lisis se colocó en ambos tubos 400μl de Buffer AP1 utilizando una micropipeta N° 1000, y solo en el tubo G4.1 se añadió 4μl de RNasa con una micropipeta N° 20, se les dió vórtex por 30 segundos hasta homogeneizar la muestra, y se incubó por 10 minutos a 65° C para permitir que el ARN, proteínas precipitadas y polisacáridos se separen del ADN. Para terminar con esta fase de lisado se agregó 130μl de Buffer P3 con micropipeta N° 200 (este, y los pasos siguientes se aplican de igual forma en ambos tubos, a menos que se indique lo contrario), nuevamente se dió vórtex por 30 seg y se incubó por 5 minutos en un cooler - gradilla con el fin de que precipiten las proteínas y polisacáridos. Ya que la mayoría de lisados vegetales son viscosos y el precipitado se forma en grandes cantidades, fue necesario además centrifugar por 5 minutos a 14000 rpm hasta haberse formado el pellet.

Posteriormente, se pipeteó el lisado (sobrenadante) y se lo trasladó a una columna de color lila con tubo colector. La columna morada retiene la mayor parte de los precipitados y restos celulares, pasando al tubo colector solo una pequeña parte de esto y el lisado al centrifugarlo por 2 minutos a 14000 rpm, formándose un nuevo pellet. Se eliminó la columna morada y se pipeteo los aproximadamente 450 ul de sobrenadante del tubo colector (sin tocar el pellet)  a un nuevo tubo con tapa.

Con el fin de obtener un ADN “puro”, se realizó un lavado añadiendo 675 ul de Buffer AW1 (1.5 Vol del sobrenadante) y se mezcló suavemente por pipeteo; se transfirió 650 ul de la mezcla a una columna de color blanco con tubo y se centrifugó por 1 minuto a 8000 rpm. El resultado de esto fue que en la columna blanca se quede el ADN y se filtre el sobrante al tubo colector, el cual se eliminó. Después, en un nuevo tubo sin tapa, se colocó la comuna blanca y se añadió 500 ul de Buffer AW2, y se centrifugó por 1 minuto a 8000 rpm. El sobrenadante obtenido se desechó y se re utilizó el tubo colector, agregando nuevamente 500 ul de AW2 a las columnas, y se centrifugó por 2 minutos a 14000 rpm, eliminando una vez más el sobrenadante. Para asegurar que en la columna blanca la membrana quede totalmente seca y libre de etanol, se vuelve a centrifugar por 2 minutos a 14000 rpm, y se desechó el tubo colector junto con lo que se filtró.

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