Fundamento De La Pcr

JOSE GUADALUPE ESTRELLA DE LOS SANTOS

INGIENERIA EN BIOTECNOLOGIA 5-.A T/M

INGIENERIA en genética aplicada

PROFESOR: Alejandro Brena becerril

31-Mayo-14

“CUESTIONARIO SOBRE SITUACIONES DE CONTROL DE LA PCR”

1. Dé al menos tres recomendaciones sobre cómo preparar y conservar los reactivos que se utilizarán en PCR, por ejemplo, la taq polimerasa y los dNTPs.

 utilización de reactivos y tubos estériles, así como puntas resistentes a aerosol, uso de guantes, colocar controles de agua.

 Utilizar guantes durante todo el proceso de manejo de muestras, material fungible y de vidrio, y extracción de RNA. Las RNasas están presentes en grandes cantidades en la piel y es la mayor vía de contaminación de RNasas. Durante la extracción intentar trabajar lo más rápido posible para minimizar la exposición con RNasas y evitar la degradación del RNA.

 Se conservan en congelación las soluciones y en el caso de los buffers en temperatura ambiente y en un lugar estéril.

2. ¿Qué concentraciones de los siguientes reactivos debe haber en una PCR estándar para un volumen total de 50 μl? dNTPs, magnesio, oligo forward, oligo reverse, enzima, buffer, agua y ADN.

Reactivos Volumen (50 μl final)

dNTPs 1 μl

magnesio 3 μl

oligo forward 5 μl

oligo reverse 5 μl

enzima 0.2 μl

buffer 5 μl

agua 29.8 μl

ADN 1 μl este cambia según las reacciones que se vayan a hacer

3. Indique las condiciones de temperatura y tiempo que se utilizan al llevar a cabo la PCR en un termociclador y cuántos ciclos se recomienda llevar a cabo para tener una amplificación adecuada del ácido nucleico.

1. La primera es a 95ºC (y a este paso se le llama desnaturalización) durante la cual las dobles

cadenas del ADN se abren o desnaturalizan, quedando en forma de cadenas sencillas.

2. La mezcla es enfriada hasta los 55 °C (alineamiento), en este paso los primers se unirán a las regiones complementarias de las moléculas de DNA separadas.

3. Se lleva a una temperatura de hasta 72°C (alargamiento ó polimerización), en esta la taq polimerasa comienza sintetizar un nuevo ADN, comenzando por las regiones en doble cadena, en donde cada uno de los primers se une al molde original de la cadena de DNA.

*El numero recomendado de ciclos es de 30 veces; debido que con el primer ciclo solo se sintetizaran los primeros fragmentos del DNA genómico; por lo tanto en el segundo ciclo la polimerasa sintetizará 2 fragmentos largos copiados directamente del ADN y 2 fragmentos del tamaño

esperado, que es el tamaño que hay entre los dosoligonucleótidos que hemos usado. De esta forma con cada ciclo aumentará el número de fragmentos del tamaño que queremos hasta incluso llegar

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