Fundamento de la cromatografía por absorción

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OBJETIVOS

Alumno:

• Establecer el mecanismo por el cual interaccionan las moléculas de fluoresceína y azul de metileno para su separación, además de comprobar dicha separación evaluando el perfil de elución.

Fundamento de la cromatografía por absorción

Se basa en el diferente grado de adsorción de cada compuesto orgánico sobre la superficie de una sustancia químicamente inerte (adsorbente), de modo que el compuesto se ve atraído a zonas polares de la superficie del adsorbente por fuerzas electrostáticas, quedando reversiblemente ligado a la misma. Para que el proceso ocurra es necesaria la presencia de un disolvente, o mezcla de disolventes, que interaccionan con el adsorbente y los compuestos de la mezcla; esa interacción triple entre soluto, disolvente, y adsorbente, establece las proporciones relativas que se fijan y migran, a través del adsorbente, los diferentes solutos y por tanto, determina la separación entre los mismos [1].

RESULTADOS

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Figura 1. Perfil de elución para la separación de fluoresceína (línea azul) y azul de metileno (línea roja). En el eje de las abscisas se muestra el volumen de elución en ml y en el eje de las ordenadas se observan las lecturas de absorbancia obtenidas para cada longitud de onda.

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DISCUSIÓN

La cromatografía de adsorción es la forma clásica de cromatografía ideada por Tswett por primera vez en 1903, con la que logró separar diferentes pigmentos vegetales [2] . La adsorción es un fenómeno (físico) de superficie en el cual diversas sustancias son atrapadas en la superficie de un material, es decir, se acumulan en una determinada superficie interfacial formándose una película del material retenido en la superficie del cuerpo adsorbente, ya sea este sólido o líquido; este proceso implica una interacción de diferentes fuerzas ya sean físicas o químicas [3] .

Para llevar a cabo la separación de estos dos componentes (azul de metileno y fluoresceína), se procedió a montar el sistema cromatográfico de adsorción en el que se aprovechan las propiedad del analito o analitos que queremos separar [3] , la mezcla está hecha del colorante azul de metileno y de la fluoresceína donde cada componente de la mezcla se adsorbe con distinta fuerza, lo cual origina que el analito se retenga en la fase estacionaria, es decir, se adsorba, y los demás componentes se eliminen.

El primer colorante que se extrajo fue el azul de metileno, en el que se empleó como fase móvil al agua destilada a través de una columna de adsorbente (columna de vidrio), cuyo analito fue adsorbido en la superficie de la fase estacionaria sólida, la cual debe ser más polar que la fase móvil [5] (alúmina ácida previamente hidratada), formando así una “cama” de partículas que se dividen de modo que el área de absorción sea máxima, es decir que dichas partículas se distribuyen a lo largo de la alúmina para atrapar la mayor cantidad posible del analito a separar; cuando existe un equilibrio entre la fase estacionaria y la móvil permite la separación del analito deseado [3] . El primer colorante extraído fue el azul de metileno, esto se debe a que nuestro adsorbente y nuestra fase estacionaria es la alúmina ácida por lo que al ser de carácter ácido esta se encuentra protonada, por lo que al observar detenidamente la figura 2 en círculo rosa se aprecia que de igual forma la molécula se encuentra protonada por lo que éstas dos cargas se van a repeler evitando que el azul de metileno se pueda unir a la alúmina, ahora por otro lado al observar la figura 3 la fluoresceína la cual es una molécula altamente polar (ésta polaridad se la confieren sus moléculas de oxígeno por ser de carácter electronegativos), esta electronegatividad favorece a que la alúmina ácida forme puentes de hidrógeno (por la mayor disponibilidad de éstos en la fluoresceína), lo que induce a una mayor cantidad de interacciones y por lo tanto, se puede retener la fluoresceína en la fase estacionaria; además debemos de recordar que la fase móvil utilizada para éste colorante fue el agua destilada se sabe que la fluoresceína es insoluble en agua por lo que se considera un factor más a favor para evitar su elución. Cabe destacar que esta cromatografía se basa en el grado de adsorción de cada compuesto orgánico sobre la superficie de una sustancia químicamente inerte (adsorbente), de modo que el analito en cuestión se ve atraído a zonas polares de la superficie del adsorbente por fuerza electrostáticas, quedando reversiblemente ligado a la misma. Para que ocurra dicho proceso es necesario la presencia de un disolvente o disolventes que interaccionen con el adsorbente y la mezcla a separar [5].

Una vez obtenidas las fracciones de eluato, se espera la obtención de eluatos incoloros antes de cambiar la fase móvil de esta manera nos aseguramos que el colorante azul de metileno salió completamente y no quedaron restos en el sistema cromatográfico (evitando interferencias), después de ello, se cambió la fase móvil por regulador de fosfatos (K2HPO4) 0.01N a pH 12, se induce con este cambio la alcalinización de la alúmina por lo que se invierten los papeles, es decir, si anteriormente se tenía retenida la alúmina con la fluoresceína por la atracción de cargas electrostáticas, al cambiar el pH de la fase estacionaria se promueve el rompimiento de estos enlaces por puentes de hidrógeno de la fluoresceína con la alúmina, ahora éstas moléculas se repelen ocasionando que la molécula afín a la alúmina sea el azul de metileno, permitiendo así la fluidez sobre la columna a la fluoresceína. Este cambio de afinidad entre el adsorbente y los analitos se da principalmente a la característica que estas atracciones electrostáticas son reversibles.

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