Herramientas para genetica y genoma

Herramientas para genética y genómica: perfiles

INTRODUCCIÓNLa base genética de la enfermedad está determinada por la herencia de genes que contienen secuencias específicas de ADN. La expresión fenotípica de estos genes, a través de la síntesis de proteínas específicas, implica la interacción con señales ambientales que desencadenan la activación de genes particulares.

Según el dogma central de la biología, el ácido ribonucleico (ARN) se transcribe a partir de una plantilla de ADN; El ARN mensajero (ARNm) se traduce luego en proteína ( figura 1 ). La transcripción y traducción subyacen a la expresión génica.

Aproximadamente del 3 al 5 por ciento de los genes están activos en una célula en particular, a pesar de que todas las células tienen la misma información contenida en su ADN. La mayor parte del genoma se reprime selectivamente, una propiedad que se rige por la regulación de la expresión génica, principalmente a nivel de transcripción (es decir, la producción de ARN mensajero a partir del ADN). En respuesta a una perturbación celular, se producen cambios en la expresión génica que dan como resultado la expresión de cientos de productos génicos y la supresión de otros. Esta heterogeneidad molecular puede afectar cuándo y cómo se presenta clínicamente una enfermedad en un individuo con predisposición genética a una afección y cómo los individuos con una enfermedad determinada responderán a tratamientos específicos.

Los análisis de la expresión génica pueden ser clínicamente útiles para clasificar, diagnosticar, pronosticar y adaptar el tratamiento a los determinantes genéticos subyacentes de la respuesta farmacológica.

Este tema se centrará en el papel del ARNm en la célula, las plataformas para perfilar la expresión de ARNm, los desafíos en la interpretación de los datos de estos análisis y las aplicaciones clínicas emergentes de las mediciones de expresión génica. Una visión general de la genética molecular en oncología clínica se presenta por separado. (Ver "Principios de genética molecular" .)

ARN EN FUNCIÓN CELULARExisten varias clases de ácido ribonucleico (ARN). El ARN mensajero (ARNm) es el ARN que se traduce en proteína. Los ARN no codificantes no se traducen en proteínas y cumplen otras funciones en la célula. Las clases de ARN no codificantes incluyen las siguientes [ 1-6 ]:

●Transferir ARN (ARNt)

●ARN ribosomales (ARNr)

●Pequeños ARN nucleares (snRNA)

●ARN nucleolar pequeños (snoRNA)

●MicroRNAs

●ARN de interacción con Piwi (piRNA)

●ARN no codificantes largos (lncRNA), que incluyen la subclase de ARN no codificantes intergénicos grandes (lincRNA)

El ARNm representa aproximadamente el 1 por ciento del ARN total en una célula [ 7 ] y se transcribe de aproximadamente 20,000 a 25,000 genes que codifican proteínas en el genoma humano [ 8 ]. Después de que el ARNm se transcribe desde el ADN, generalmente sufre modificaciones adicionales, incluida la adición de una tapa de metil-guanosina (tapa 5 '), la adición de una serie de adeninas al extremo 3' del ARN (cola poli-A) y el empalme de intrones ( figura 2 ) [ 1 ]. El ARNm se transporta desde el núcleo al citoplasma, donde se traduce en proteína. El ARNm sirve como un intermediario transitorio entre el ADN y la proteína y se degrada en minutos a horas [ 1 ].

Los microARN (miARN) son ARN pequeños, endógenos, no codificantes (longitud 18 a 24 nucleótidos) que regulan la expresión génica uniéndose a las regiones no traducidas de ARNm e induciendo la degradación de ARNm o inhibiendo la traducción de proteínas, reduciendo a su vez la expresión génica. La elaboración de perfiles de miRNA se puede hacer utilizando métodos similares a los utilizados para los mRNA. Se encuentra disponible una base de datos de búsqueda de miRNAs caracterizados ( www.mirbase.org/ ).

Los lncRNA son ARN no codificantes con diversas funciones definidas por su longitud de> 200 nucleótidos. Los lincRNA son un subconjunto de los lncRNA definidos por la falta de superposición con los genes que codifican las proteínas [ 5 ]. Sin embargo, los genes que codifican proteínas también pueden producir variantes de transcripción no codificantes, aumentando aún más la diversidad de lncRNA. Se desconoce la relevancia funcional de la gran mayoría de los> 19,000 lncRNAs, pero la capacidad de diferentes lncRNAs para ajustarse a diversas estructuras o interacciones parece influir en muchos procesos celulares [ 6,9 ]. Al igual que con los miRNA, los lncRNA pueden perfilarse utilizando técnicas similares a las utilizadas para los mRNA.

MEDICIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GENESDado que el ARNm representa el puente funcional entre el ADN y la proteína, las alteraciones en el ARNm pueden servir como marcadores para la activación o inhibición de un gen particular.

El desafío en la medición de ARN se relaciona con la susceptibilidad de los ARN a la degradación por ribonucleasas (RNasas). Los métodos de detección de ARN aprovechan la estructura monocatenaria del ARN y su complementariedad con el ADN del que se transcribió.

Perfiles de expresión de genes individuales o paneles de genes pequeños  :  antes del desarrollo de la tecnología de secuenciación de microarrays y genomas completos, los métodos disponibles para medir la expresión de genes incluían:

●Northern blot (ver 'Northern blot' a continuación)

●Ensayo de protección de ribonucleasa (ver 'Ensayo de protección de ribonucleasa' a continuación)

●Hibridación in situ (ver 'Hibridación in situ' a continuación)

●Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT-PCR) (ver 'Reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real' a continuación)

●Conjuntos de ADNc manchados (consulte 'Conjuntos de ADNc manchados' a continuación)

Una comparación de estos métodos se resume en una tabla ( tabla 1 ).

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