Hidrolisis De Las Grasas Por La Lipasa Pancreatica

LABORATORIO Nº4

DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: ENZIMAS DIGESTIVAS

1. Aspectos teóricos:

1.1 -Amilasa salival y pancreática.

La saliva es una mezcla derivada de la secreción de 3 pares de glándulas, las parótidas, submaxilar y sublingual, como también de pequeñas glándulas mucosas ubicadas difusamente sobre la mucosa de la boca.

La cantidad normal secretada en una persona adulta es de 1 a 1,5 Iitros en 24 horas. La composición de la saliva es un 99,5% H2O y 0,5 % de sólidos orgánicos e inorgánicos, el pH oscila entre 6,2 y 7,4. Los principales componentes orgánicos son las glicoproteínas, proteínas (albúmina, globulinas) y carbohidratos. Los componentes inorgánicos principales son calcio, sodio, potasio, magnesio y fósforo.

La secreción pancreática es un líquido acuoso no viscoso, que tiene un contenido de H2O semejante al de la saliva y que lleva cierta cantidad de proteínas y compuestos inorgánicos, principalmente Na+, K+, HCO3- y Cl-, además están presentes en pequeñas cantidades Ca+2, Zn+2 y HPO4-2. El pH del jugo pancreático es claramente alcalino de 7,5 a 8,0 o mayor. En la secreción pancreática se encuentran numerosas enzimas, la tripsina, amilasa, carboxipeptidasa, lipasa y otras.

La enzima -amilasa, presente en la saliva, inicia la degradación del almidón, la principal fuente de carbohidratos de la dieta humana. Esta enzima hidroliza al azar los enlaces  (14) que unen residuos de glucosa en el almidón, a excepción de los enlaces cercanos a los extremos y a los puntos de ramificación de las cadenas. Por la acción de esta enzima activada por iones cloruro, en la boca la longitud de la cadena del almidón se reduce de varios miles a unas ocho unidades de glucosa. La alta concentración de protones del estómago inactiva la -amilasa salival. La digestión del almidón continúa en el intestino delgado por la acción de la -amilasa pancreática, como producto se forma una mezcla del disacárido maltosa, el trisacárido maltotriosa y oligosacáridos conocidos como dextrinas que poseen ramificaciones  (16).

Ecuación 4.1

El almidón y dextrinas complejas al ser tratados con una solución de yodo dan un complejo de coloración azul, mientras que las dextrinas más simples, la maltotriosa y maltosa no dan una reacción positiva. Así, la acción de la -amilasa sobre polisacáridos puede ser seguida midiendo la decoloración del complejo azul hasta alcanzar el punto acrómico (solución incolora).

La maltosa y otros carbohidratos reductores producidos en la reacción pueden ser detectados por el test de Benedict. Este método es cualitativo, consiste en una solución alcalina de Cu2+ que se encuentra formando un complejo con citrato. El ión cúprico es reducido a Cu1+ por compuestos reductores con formación de hidróxido cuproso amarillo o de óxido cuproso rojo. El cambio de coloración o la formación de un precipitado rojo-ladrillo (Cu2O) indica la presencia de un compuesto reductor. Carbohidratos reductores también pueden detectarse y cuantificarse por los ensayos de Somogyi-Nelson y de la o-toluidina.

1.2 Lipasa pancreática, efecto de la sal biliar.

La mayoría de los lípidos de la dieta son triglicéridos, esteroles y fosfolípidos de membrana de origen vegetal y animal. La digestión de los lípidos ocurre en el duodeno gracias a la secreción pancreática.

La lipasa pancreática actúa en la interfase H2O / aceite de las gotitas de lípidos finamente emulsificadas, formadas por la agitación mecánica en el intestino en presencia de sales biliares.

La degradación de lípidos en el sistema digestivo es incompleta, los triglicéridos son transformados a una mezcla de diglicéridos, monoglicéridos, glicerol y ácidos grasos.

La reacción puede ser seguida por el cambio de pH causado por la disociación de los ácidos grasos formados a través del tiempo de la reacción ocupando un indicador ácido-base, compuestos que son ácidos o bases cuyas distintas formas iónicas tienen diferentes colores. El rojo de fenol es un ácido débil con un intervalo de transición entre valores de pH 6,4 y 8,0; la forma protonada es amarilla y la forma básica es roja. Una transición de pH de un medio neutro o alcalino a pH ácido va acompañada de un cambio de coloración, de rojo a amarillo.

Lipasa

Triglicéridos diglicéridos + monoglicéridos + glicerol + ácidos grasos

Sales biliares ( R-COO- + H+)

Ecuación 4.2

2. Objetivos.

Determinar la actividad enzimática de las enzimas digestivas -amilasa y lipasa de acuerdo a las diferentes propiedades que presentan los reactantes y productos de las reacciones catalizadas.

3. Parte experimental.

3.1 Materiales

• baño termostatizado / termómetro

• trípode / rejilla / mechero

• espectrofotómetro / celdas

• 2 gradillas

• 2 pipetas graduadas de 10 ml

• 2 pipetas graduadas de 5 ml

• 1 pipeta graduada de 1 ml

• 1 pipeta graduada de 1 ml

• 1 pipeta graduada de 2 ml

• 1 pizeta

• 1 vaso precipitado de 100 ml

• 1 vaso precipitado de 250 ml

• 1 vaso precipitado de 500 ml

3.2 Reactivos

• Almidón 0,5 % en tampón fosfato 0,1 M pH 6,7

• Tampón fosfato 0,1 M, pH 6,7

• NaCl 1 %

• Reactivo de Benedict

• Solución de yodo 2,5 mM

• Pancreatina 1 mg/ ml, como

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