IDENTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE PROTEASAS

IDENTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE PROTEASAS

I. INTRODUCCIÓN:

Las enzimas son catalizadores biológicos que aceleran las reacciones químicas. Algunas frutas contienen ciertas proteasas, enzimas específicas, que digieren o desnaturalizan las moléculas de proteínas presentes en la gelatina. Existen diversos factores que afectan la acción enzimática, tales como temperatura, pH, concentración de sustrato, presencia de cofactores (minerales y vitaminas), inhibidores, etc.

Algunas frutas producen enzimas con actividad proteasa, es decir, que rompen las proteínas al romper las uniones covalentes entre los aminoácidos que la constituyen. Por ejemplo, la papaya produce una proteasa conocida con el nombre de papaína.

La detección e identificación de inhibidores de proteasas (IP) en semillas ha sido extensamente descripta. La función de estos inhibidores en plantas no es bien conocida, se ha postulado que actuarían como proteínas de reserva ya que se acumulan durante la maduración de la semilla, o que regularían la actividad de proteasas endógenas facilitando el almacenamiento de proteínas en la maduración. Otra función que se les atribuye a los IP en plantas es su participación en los eventos de defensa.

Se ha descrito que el ataque de insectos aumenta la producción de IP, los cuales inhiben la actividad de proteasas digestivas en el intestino del insecto pudiendo conducir a malnutrición, reducción del crecimiento y en algunos casos su muerte. También se han descrito IP en plantas con actividad antifúngica.

En el desarrollo de esta práctica trataremos de identificar la presencia de proteasas en diferentes partes de frutos vegetales, así como la influencia de la temperatura sobre la actividad de las proteasas en función del tiempo.

II. MATERIALES Y MÉTODO:

Para empezar, se preparó licuados a base de cáscara, pulpa y pepas de papaya y piña (corazón en lugar de pepas para la piña) por separado, los cuales fueron luego filtrados en vasos de precipitados con la ayuda de un embudo y papel filtro + gasa.

A partir de cada uno de los filtrados obtenidos (cáscara, pulpa y pepas/corazón de papaya y piña), se preparó 3 tubos de ensayo con 3 ml c/u de dichas soluciones. De ellos, se llevó uno de cada 3 tubos de cada filtrado a baño maría hirviente durante 10 minutos, otro de ellos a baño maría hirviente durante 30 minutos, y el último de ellos se mantuvo a temperatura ambiente.

Pasado este tiempo transferimos 1 ml de cada uno de los tubos a otro tubo que contenía gelatina previamente fluidificada (por incubación a 37ºC por 30 minutos), tras lo cual se incubó todas las muestra a 37ºC durante 1 hora. Finalmente, se llevó a refrigeración todas las muestras durante 30 minutos para verificar la solidez o fluidez de la gelatina que indicaría la actividad de las proteasas presentes en las distintas partes de los frutos ensayados.

III. RESULTADOS:

• Siguiendo las indicaciones como se muestra en el esquema, realizamos las pruebas para identificación de presencia y actividad de las proteasas presentes en distintas partes de dos frutas distintas, tanto papaya como piña, así como la influencia de la temperatura sobre su actividad catalítica.

...