INGENIERÍA GENÉTIA . PURIFICACIÓN DE ADN

INGENIERÍA GENÉTIA

PURIFICACIÓN DE ADN

El primer paso en la purificación de ADN suele ser la homogeneización de células y el aislamiento de los núcleos de los que se extrae el ADN. Los núcleos se extraen con una solución salina amortiguadora que contiene un detergente, como el SDS1, que sirve para destruir los núcleos y membranas y así liberar el ADN. El detergente también inhibe cualquier actividad de nucleasa presente en la preparación.

Los siguientes pasos de la purificación es separar el ADN de los materiales contaminantes, como el RNA y las proteínas. La eliminación se efectúa al agitar la mezcla con un volumen de fenol, un desnaturalizante activo de proteínas que causa que éstas pierdan su solubilidad y se precipiten en la solución.

Como el fenol y las soluciones salinas amortiguadoras son inmiscibles, la suspensión sólo se centrifuga para separar las fases, lo que deja el ADN y el RNA en solución con la fase acuosa superior y la proteína presente como precipitado en el límite de las dos fases. La fase acusa se retira y del tubo y se somete a ciclos repetidos de agitación con fenol y centrifugación hasta que ya no se retire más proteína de la solución. Después los ácidos nucleicos se precipitan de la solución con la adición de etanol frío. Con frecuencia el etanol frío forma una capa arriba de la solución acuosa de ADN y éste se enrolla en una varilla de vidrio conforme sale de la solución en la interfase entre el etanol y la solución salina. En cambio, el ARN sale de la solución como un precipitado floculento que se asienta en el fondo del recipiente.

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Figura 1. Extracción y purificación de ADN. Se requiere que el ADN esté libre de otros compuestos celulares.[pic 2]

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Después de este procedimiento de purificación inicial el ADN se disuelve de nuevo y se trata con ribonucleasa para retirar el ARN contaminante. A continuación la ribonucleasa se destruye con una proteasa, que se retira mediante desproteinización con fenol, y el ADN se precipita con etanol.

El ARN puede purificarse en forma similar con ADNasa en los pasos finales de la purificación en lugar de ribonucleasa.

En un método alternativo de purificación de ADN se usan membranas o matrices a las cuales en ADN se unirá en condiciones específicas.  En la actualidad la extracción del ADN es necesaria en multitud de aplicaciones de la biología molecular. Existe un gran número de kits comerciales. Se ha demostrado que la sensibilidad de detección de la PCR es diferente para diferentes kits de ADN

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Figura 2. Kit comercial de extracción y purificación de ADN. BiotoolsThe Leading PCR company

SEPARACIÓN DE ADN POR ELECTROFORÉSIS EN GEL.

Ésta técnica es entre las diversas utilizadas también para fraccionar proteínas, se utiliza mucho para separar ácidos nucleicos con masa molecular diferente (o sea, la longitud del nucleótido). Las moléculas pequeñas de RNA y ADN de unos cuantos cientos de nucleótidos o menos siempre se separar por electroforesis en gel de poliacrilamida. Las moléculas más grandes tienen problemas para pasar por la poliacrilamida de enlaces cruzados y por lo general se fraccionan en gel de agarosa, que es más poroso. La agarosa es un polisacárido extraído de un alga marina; se disuelve con un amortiguador caliente, se vierte un un molde y se gelatiniza con el simpel descenso de la temperatura. La separación de las moléculas de ADN mayores a 25 kb suele hacerse mediante la técnica de electroforesis en campo con pulsos en la que la dirección  del campo eléctrico en el gel se cambia en forma periódica, lo que ocasiona que las moléculas de ADN se reorienten durante la migración.

Después de la electroforesis, los fragmentos de ADN en el gel se visualizan empapando el gel en una solución de colorante como bromuro de etidio. Éste se intercala en la doble hélice y hace que las bandas de ADN presenten fluorescencia cuando se ven con radiación ultravioleta.

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Figura 3. Separación de fragmentos de restricción de ADN por electroforesis en gel. Arriba, el ADN se incuba con una enzima de restricción, que corta los fragmentos. La mezcla de fragmentos se introduce en una ranura o pozo en una placa de agarosa y se aplica corriente eléctrica. Las moléculas de ADN con carga negativa emigran hacia el electrodo positivo y se separan por tamaño. Abajo, todos los fragmentos de ADN que están presentes en un gel pueden revelarse mediante la inmersión del gel en una solución de bromuro de etidio para luego observar el gel con luz ultravioleta.

HIBRIDACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO.

La hibridación de ácido nucleico comprende varias técnicas relacionadas que se basan en la observación de que dos moléculas de ácido nucleico de cadena sencilla con secuencia de bases complementaria pueden formar un híbrido de doble cadena.

Los experimentos que utilizan la hibridación de ácidos nucleicos requieren la incubación de dos poblaciones de ácidos nucleicos complementarios de cadena sencilla en condiciones (fuerza iónica, temperatura, etc) que promuevan la formación de moléculas de cadena doble.

En muchos casos una de las poblaciones de ácidos nucleicos de cadena sencilla que se emplea en el experimento de hibridación se encuentra dentro de un gel.

Considérese una población de fragmentos de ADN que se prepararon a partir de ADN genómico y se fraccionaron por electroforesis en gel. Para realizar la hibridación, el gel se trata a fin de hacer al ADN monocatenario; éste se transfiere entonces del gel a una membrana de nitrocelulosa y se fija en la membrana por calentamiento a 80°C en vacío. El procedimiento por el que se transfiere ADN a la membrana se denomina transferencia o manchado.

Una vez que el ADN se une, la membrana se incuba con una sonda2 de ADN (o ARN) de cadena sencilla y con marca radiactiva capaz de formar híbridos con un grupo complementario de fragmentos.  El experimento recién descrito se demuestra en la figura 4 conocido como método de Southern (en honor de Edwin Southern, su creador). Con el método de transferencia de Southern pueden identificarse uno o unos cuantos fragmentos de restricción de ADN.

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Figura 4. Identificación de la localización de fragmentos de ADN específicos en un gel por el método Southern. Como se describe en la figura, los fragmentos fraccionados del ADN se desnaturalizan y transfieren a una membrana de nitrocelulosa, que se incuba con sondas de ADN o ARN con marca radiactiva.  La localización de los fragmentos híbridos se realiza mediante autorradiografía. Durante el procesamiento de manchado, la acción capilar atrae al amortiguador hacia arriba da las toallas de papel. Conforme el amortiguador se mueve por el gel elecctroforético, disuelve los fragmentos de ADN y los transfiere a la superficie de la membrana adyacente.

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