Informe nº 3 Cromatografía en exclusión

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Informe nº 3

Cromatografía en exclusión

Asignatura: Bioquímica General                            

Integrantes: Valentina Prado, Yarella Novoa  

Profesores: Ruth Gonzalez, Nicolás Pacheco                                                                                            

Carrera: Química y Farmacia

Institución: Universidad Andrés Bello

Fecha: 15/06/2021

Introducción

La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas, sirve para separar aminoácidos, componentes de una tinta, entre otros.

Es una técnica útil para separar compuestos de diferente peso molecular. La base de la separación del método es la propiedad del gel (Sephadex) de fraccionar solutos de acuerdo a su tamaño molecular. Cuando se coloca una solución acuosa con macromoléculas que difieren en tamaño y se pasa a través de una columna empacada con gel de dextrano (Sephadex) las moléculas más grandes son incapaces de penetrar los poros del gel (se excluyen) y se mueven más rápido a través de la columna (tienen menos trayecto que recorrer) que las pequeñas. Estas últimas, difunden a través de los poros según su tamaño. Las diferentes moléculas eluyen la columna en una secuencia decreciente en tamaño molecular. (1)

Consiste en dos fases: fase móvil que consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) que arrastra a la muestra a través de una fase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido.

Algunas características y condiciones importantes de esta técnica:

- Que la muestra no hace interacción química con la fase estacionaria, ni con la fase móvil.

- La fase móvil no debe solubilizar fase estacionaria ni con la muestra.

-Lo común es recoger fracciones del líquido que sale o eluye, para analizarlas individualmente y así identificar el perfil de elución de la cromatografía.

- El aumento de la temperatura favorece la resolución de la muestra, ya que la difusión se produce con mayor facilidad.(2)

Objetivos

-Construir un cromatograma de absorbancias de analitos v/s los números de fracciones.

-Determinación de analitos en base a su orden de elución y pesos moleculares.

Materiales

− Columna de vidrio 1.3 x 15 cm.

 − Sephadex G – 75

− Muestra: azul dextrano 0.5% PM (x), y dicromato de potasio (K2Cr2O7) al 0.5%.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

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1. Montaje de la columna: En una columna cromatográfica ya montada, empacada con resina tipo “sephadex”, esta se lava con amortiguador fosfato 10 mM pH 7,5.

1. Se carga la columna con 90 ul de azul dextrano, 50 ul de muestra proteica (40 mg/ml), 20 ul de cromato de potasio y 90 ul de glicerol

1. Se eluye la muestra con buffer fosfato,  se recolectan 10 fracciones.

1. Se miden en el espectrofotómetro a 280 nm/595 nm/420 nm.

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DISCUSIÓN

Mediante cromatografía de exclusión se determinó los analitos siguientes como lo son el azul de dextrano, la albumina y el cromato de potasio con un total de 15 fracciones analizadas, la cual a través de la absorbancia y peso molecular podemos ver el orden de elución de estos tres analitos, utilizando como referencia sus pesos moleculares, se puede determinar que analito va eluir primero en esta experiencia el azul dextrano eluira en primera instancia debido que este posee el mayor peso molecular con un valor de 2103kDa de los 3 analitos. Con respecto al segundo analito que  eluirá será la albúmina ya que presenta un peso molecular de 67 kDa, con un peak máximo de absorbancia de 0,21nm y el más alto de los tres analitos. El último en eluir es el Dicromato de potasio, ya que presenta un peso molecular 249,185Da, logrando un peak de máxima absorbancia de 0,089nm.(3).

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