LA ACTIVACIÓN Y LA INHIBICIÓN DE LA POLIFENOL OXIDASA EN LA UVA

LA ACTIVACIÓN Y LA INHIBICIÓN DE LA POLIFENOL OXIDASA EN LA  UVA

1. INTRODUCCIÓN :

Cursos prácticos de bioquímica pretenden introducir a los estudiantes  las propiedades básicas de los materiales biológicos y  satisfacer los deseos de los estudiantes para llevar a cabo investigaciones de investigación similar. El estudio de la activación y la inhibición de las enzimas proporcionan un área de tema único para lograr este último propósito. Sin embargo, el número de enzimas adecuadas para el estudio de ambos efectos es limitado debido a los procedimientos de purificación sofisticadas ya que  implican un equipo que no es disponible comúnmente en el laboratorio práctico.

polifenoles oxidasa de uva es una enzima ideal para estos estudios, ya que tiene un protocolo de purificación fácil (menos de tres horas) y se encuentra como un precursor inactivo (forma latente) que puede ser activado por varios agentes.

Además, esta enzima no está muy alejada de la vida cotidiana de los estudiantes, ya que se relaciona con el proceso de tostado indeseable de frutas, jugos y verduras. Este pardeamiento es causado principalmente por la oxidación de fenoles en el tejido de la planta por esta proteína que contiene cobre multifuncional. Cataliza tanto orto-hidroxilación de monofenoles a o-difenoles (actividad cresolasa) y la posterior oxidación de o-difenoles a o-quinones (actividad catecolasa). Este último reacciona con sí mismos y también con aminoácidos y proteínas para dar las características pigmentos oscuros que disminuyen el valor comercial de las frutas y verduras.

Este documento ilustra algunos de los inhibidores utilizados para controlar la actividad de la polifenol oxidasa y algunos de los agentes capaces de la activación de la enzima latente, cuyo estudio y el mecanismo de acción son de gran interés industrial.

1. MATERIALES Y MÉTODOS

Reactivos bioquímicos eran de Sigma (St Louis, MO), metabisulfito de sodio de Merck y todos se usaron sin purificación adicional.

Enzyme purificación de uva polifenol oxidasa se purificó mediante el uso de Triton X-114 partición de fase.  La enzima obtenida de este modo fue latente, y tuvo que ser activado antes de que pudiera ser medido.

actividad de la oxidasa de polifenol ensayo enzimático hacia catecol terc-butilo (TBC) se determinó en un espectrofotómetro de registro a 400 nm.  La mezcla de reacción contenía 1,5 ml 50 mM de tampón de acetato, pH 5,0, 1 ml TBC 5 mM y 0,2 ml de

 extracto de enzima. La enzima se diluye normalmente (por lo general 1: 10- 01:50) para que el aumento lineal inicial en A era 0,1 a 0,2 por min. Una unidad de enzima se define como la cantidad de la enzima que cataliza la transformación de 1 µmol sustrato / min bajo las condiciones de ensayo.

La inhibición de la enzima Los experimentos de inhibición se llevaron a cabo con polifenol oxidasa completamente activa. Para ello, los estudiantes ajustarse la solución de enzima latente a pH 5,0 con ácido acético 100 mM. Estos experimentos se llevaron a cabo mediante la adición de cantidades crecientes de inhibidor al medio de reacción estándar. El inhibidor varió desde 0 hasta 600  µM, 0-650 µ M y 0-250 µM en el caso del ácido cinámico, ácido ascórbico y metabisulfito, respectivamente.

Activación de la enzima Para estos experimentos, la enzima se mantuvo latente en el tampón de extracción (pH 7,3). En los ensayos de activación, la muestra se preincubó con tripsina (1000 U / ml) o con detergente (10 mM) durante 5 o 15 minutos, respectivamente, antes de la adición al medio de reacción estándar.

1. LA INHIBICIÓN POR ANÁLOGOS ESTRUCTURALES

velocidad de reacción enzimática se puede disminuir por un grupo de sustancias llamadas inhibidores. Desde su estudio, información valiosa que se ha obtenido en el mecanismo de la enzima, especificidad de sustrato y los grupos químicos que participan en la catálisis y la estructura del centro activo. Los tres tipos principales de inhibición (competitivos, no competitivos y no competitivos) pueden ser analizadas en términos de la ley de velocidad de Michaelis-Menten.

El inhibidor elegido para la polifenol oxidasa fue el ácido cinámico, un análogo estructural del sustrato, que tiene el grupo hidroxilo en posición meta en lugar de en la posición orto. 4 Esto permite la unión reversible de la inhibidor competitivo de la enzima y deniega el acceso del sustrato al sitio activo.

Para analizar este efecto, una representación de Lineweaver-Burk (1 / v vs 1 / [S]) de inhibición competitiva lineal se utiliza (datos no mostrados), junto con una representación de Dixon (1 /v  vs [I]]) para comprobar si la inhibición es una verdadera inhibición competitiva lineal o no. Si el valor ordinal del punto donde las líneas se intersectan en la trama Dixon es el mismo que el  1/ Vmáx   obtenido en la representación de Lineweaver-Burk, el tipo de inhibición es claramente una inhibición competitiva lineal. Esto permite a los estudiantes a distinguir esta inhibición competitiva de la inhibición mixta, ya que en ambos casos las líneas se cruzan por encima del eje horizontal en la representación de Dixon. La Figura 1 muestra el K1 (329 µM) obtenido por los estudiantes con la representación de Dixon.

[pic 1]

La inhibición de la polifenol oxidasa por el ácido cinámico con dos concentraciones de sustrato (gráfica Dixon): (a) 0,83 mM. (B) 1,67 mM.

 Inhibición competitiva 

Donde V es la velocidad de reacción, Km es la constante de Michaelis-Menten, Vmax es la velocidad máxima, y [S] es la concentración de sustrato

LA INHIBICIÓN POR AGENTES REDUCTORES

Los agentes reductores parecen inhibir la polifenol oxidasa, aunque en realidad prevenir reacciones no enzimáticas posteriores, de tal manera que no se formen productos coloreados. Los modos de acción diferentes en función del agente reductor utilizado y los experimentos incluyen dos de los más importantes de la industria de la comida y el vino.

El primero es el ácido ascórbico, que actúa principalmente mediante la reducción de la quinona nuevo a la original o-difenol. Una vez que todo el inhibidor ha reaccionado, el producto de quinona amarillo comienza a aparecer. Sin embargo, los estudiantes se den cuenta de que la velocidad enzimática disminuye a medida que más ácido ascórbico se añade (Figura 2). Una clara disminución en la actividad se muestra cuando el ácido ascórbico alcanza 650 µM, por encima del cual el valor de la enzima es completamente inhibida debido a la inactivación de auto producido por la reacción de la naciente o-quinona en el sitio activo. El efecto se muestra en la Figura 2 se utiliza en la industria alimentaria para evitar los pigmentos marrones desagradables en verduras, mientras que son tratados antes de ser cocido, envasado o enlatado. Otro ejemplo de un agente reductor es metabisulfito de sodio, 6 que forma un producto de adición incoloro estable con quinonas. En primera este agente parece reaccionar de una manera similar al ácido ascórbico, el período de retraso aumenta con la concentración de inhibidor en el rango de 0 a 250 µM (Figura 3). Sin embargo, la disminución de la actividad es mayor que con ácido ascórbico para una concentración de inhibidor dada. Esto sugiere que metabisulfito tiene un efecto directo sobre la enzima. De hecho, este agente reductor puede unirse al centro activo de la enzima, inhibiendo directamente. Más detalles de su mecanismo de inhibición cinética se han publicado recientemente.

A pesar de la potencia inhibidora de metabisulfito de sodio,  su uso en la tecnología de los alimentos y, especialmente, en la industria del vino tiende a ser estrictamente controlada y se elimina en lo posible a causa de la creciente conciencia de su posible efecto perjudicial para la salud. Es por esta razón que los enólogos tienen que probar este nivel en cada lote de vino que hacen. Los estudiantes se dan cuenta, durante la clase de discusión final, que la dosis de disulfito utilizado depende de las uvas utilizadas para purificar la enzima.

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