Liberación in vitro de liberadora de gonadotropina

Acuicultura, 74 (1988) 75-86

Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam - Impreso en los Países Bajos

75

Sostenida liberación de hormona. I. Características de

Liberación in vitro de liberadora de gonadotropina

Hormona analógica (GnRH-A) de pellets

NANCY M. SHERWOOD ', L.W. CRIM2, J. CAROLSFELDiJ y SANDRA M. Walters

'Departamento de Biología de la Universidad de Victoria, Victoria, BC V8 W 2Y2 (Canadá)

'Laboratorio de Ciencias del Mar de Investigaciones de la Universidad Memorial, San Juan de Terranova Al C

5S7 (Canadá)

Dirección 3Present: Centro de Pesquisa e Treinamento em Aquicultura, Pirassununga, Sao Paul0

(Brasil)

(Aceptado 13 de junio 1988)

ABSTRACTO

Sherwood, NM, Crim, LW, Carolsfeld, J. y Walters, SM, 1988. liberación de la hormona sostenida.

I. Características de liberación in vitro de análogo de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH-A)

de pellets. Acuicultura, 74: 75-86.

Se describe un método para incrustar análogo de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH-A)

en pelets de diferentes matrices para producir liberación sostenida a diferentes velocidades. Los gránulos que contienen

GnRH-A se colocaron en una cámara de perfusión en vitro y la liberación del análogo era

medida por radioinmunoensayo utilizando un antisuero específico para el análogo. Matrices que contienen

25,50,75 o 100% de celulosa en combinación con colesterol resultó en GnRH-A de liberación con una inicial

estallar en 1 h de 19 a 40% del análogo de la GnRH contenida en el sedimento; una liberación acumulada de

más del 90% del análogo se produjo por 24 h. En contraste, la liberación de GnRH-A a partir de un pellet

del 5% de celulosa 95% de colesterol o el 100% de colesterol fue sólo 5.6% de la cantidad total de la

análogo a 1 h con una liberación acumulada de 18 a 21% a las 24 hy 36 a 38% en 28 días. Es

sugirieron que estas pastillas no tóxicos y de bajo costo son adecuados para la acuicultura. El colesterol

gránulos de celulosa que son de 25-100% de celulosa son potencialmente útiles con pescado madura que requieren

un GnRH-A estímulo rápido para la maduración del óvulo final y desove. El colesterol 95 o 100%

gránulos pueden ser más adecuado para la liberación sostenida de pescado en día requieren para la maduración final de la

ovario o en el desove de peces en varios días sucesivos.

INTRODUCCIÓN

Desove inducido en los peces se lleva a cabo tanto con hormonal y ambiental

manipulaciones. Una forma de tratamiento hormonal liberadora de gonadotropina es

la hormona (GnRH, también conocida como hormona luteinizante liberadora de

la hormona LHRH). Sin embargo, la inyección de la forma nativa de GnRH no es muy

efectiva en la elevación de la concentración plasmática de gonadotropina (GtH) o en la inducción del desove (Crim et al., 1988); esto es probablemente debido a la descomposición rápida

del péptido en el cuerpo. Un estudio realizado en peces de colores en la desaparición de la GnRH

administrado por vía intraperitoneal (ip) inyecciones mostraron que la concentración

de GnRH en los picos de sangre por 4 min después de la inyección; 50% de la cantidad de pico

se ha ido por 20 min y aproximadamente 90% en 45 min después de la inyección (Sherwood y

Harvey, 1986).

Para prolongar la vida de GnRH en el torrente sanguíneo sin administración frecuente,

una serie de análogos de la GnRH han sido sintetizados. Más de 2000 análogos

se han hecho (Struthers et al., 1985). Uno de los análogos que se

más eficaz en la estimulación de los acontecimientos relacionados con la reproducción en los dos peces y

mamíferos es [D-Ala ', Prog-etilamida] mamíferos GnRH (mGnRH-A). Un

inyección de este análogo en resultados trucha tratados con testosterona en un pico de concentración

del análogo en la sangre en 40 min y una reducción del pico

la concentración en un 50% a 2-3 h y 90% en 5-6 h (Crim et al., 1988). En los peces

este análogo estimula un aumento en los niveles de las hormonas gonadotrópicas circulantes

y / o induce la ovulación y el desove de sábalo, el salmón, la trucha, el arenque,

goldfish, carpa, lucioperca, quimeras, el bagre y la lubina (para ver comentarios

Crim et al., 1987; Sherwood, 1987; También ver Nacario y Sherwood, 1986; Almendras

et al., 1988; Carolsfeld et al., 1988; Marte et al., 1988).

Sin embargo, incluso el análogo de larga duración de mGnRH-A no siempre es eficaz

en la inducción del desove. Una posibilidad es que algunas especies son reproductivamente

inmaduros y requieren una estimulación GnRH más prolongada de lo previsto

por una inyección de análogo de la GnRH. Este documento y los dos posteriores

son estudios sobre el efecto de la incorporación de mGnRH-A en pellets de diferentes matrices

para prolongar la liberación. Presentamos evidencia de que ciertas combinaciones de colesterol

y celulosa proporcionar una matriz que permite que la velocidad de liberación sea variada,

protege el péptido GnRH altamente soluble en agua de la disolución al instante, se

no tóxico y barato. En el presente estudio, las características de analógico

la liberación de gránulos en una cámara de perfusión se presentan. En el segundo estudio,

los perfiles séricos de la hormona gonadotropina (GtH) y análogos de GnRH son

se muestra después de la implantación de pellets en el modelo de los pescados, el menor testosterona tratados

trucha (Crim et al., 1988). En el tercer estudio, pellets de GnRH-A se demuestran

para inducir el desove en lubina en condiciones de campo (Almendras et

. al, 1988).

MATERIALES Y METODOS

Hormonas y pellets

Los pellets que contienen aproximadamente 100, ug de [D-Ala ', Prog-etilamida]

GnRH de mamíferos (mGnRH-A) se prepara mezclando la hormona con 30 mg de matriz. Las matrices se prepararon mezclando el colesterol en polvo y celulosa en peso de manera que una pastilla de colesterol-50% de celulosa 50% contenía

15 mg de cada componente. Los seis matrices contenidas en el colesterol

siguientes porcentajes: 0,25,50,75,95 y 100%; El porcentaje restante de

cada sedimento fue de celulosa. La matriz se mezcló con una espátula o girar en una

recipiente cerrado. Se utilizaron dos métodos para determinar la cantidad de análogo

añadir a la matriz. En un método de una cantidad apropiada de la matriz era

añadido a la botella entera del análogo como fue suministrado. Sin embargo, radioinmunoensayo

del análogo en los pellets mostró que la cantidad de análogo variarse

De 50-200% entre botellas. Pesar el análogo sólo es aceptable si el proveedor

proporciona el peso del análogo por análisis de aminoácidos. El segundo

método fue disolver el análogo en agua (1 mg / ml), ensayo de la solución,

dividir la solución en alícuotas de la cantidad deseada de analógica y resecar

las alícuotas en una centrífuga de vacío refrigerada. Después se añadió la matriz

al análogo y se mezclan. Las mezclas que contienen el 95% de 100% de colesterol

se colocaron en un horno de 30 ° C durante aproximadamente 1 h antes de ser presionado. Los

matriz de polvo y la hormona fueron prensadas en un gránulo cilíndrico de 3 mm

de diámetro por 3 mm de altura utilizando una máquina de pellet (Parr Instrument Co., Moline,

IL). Pellets con 95-100% de colesterol eran frágiles y se fracturan a menos que el

mezcla se calentó antes de pulsar.

En la perfusión vitro de los pellets

Seis glóbulos se ensayaron en cada grupo con 0, 25, 50 y 75% de colesterol

matrices; cuatro gránulos se ensayaron en cada grupo con 95 o 100% de colesterol

matrices. Cada cámara de perfusión (Fig. 1) tenía un volumen de 0,3 ml antes de la

Se añadió sola pastilla. Un tapón de lana de nylon siliconizado de 3 mg se colocó en el

fondo de la cámara y una de 9 mg fue colocado en la parte superior para evitar el movimiento

de la pastilla. Se estableció un flujo continuo de fluido de perfusión utilizando

una bomba de perfusión separada (LKB 2132 bomba peristáltica microperplex) para cada

cámara. Las bombas se ajustaron para producir un flujo de 5 ml / h. La perfusión

medio era 10 MA4 salina tamponada con fosfato, pH 7,5, con 0,1% de gelatina y

Azida de sodio 0,01%. El aparato de perfusión y colector de fracciones enteras fueron

colocado en una cámara ambiental en 4 'C.

Una muestra lh de 5 ml de efluente de la perfusión se recogió de cada cámara

antes de que el pellet se colocó en la cámara. Después el sedimento se en la cámara,

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