Los Reactivos Y Anticuerpos

Los reactivos y anticuerpos. Luteolina era de Cayman Chemical

(Ann Arbor, MI). Butilado hidroxianisol (BHA), N-acetilcisteína

(NAC), necrostatin-1, Z-VAD, y cicloheximida fueron adquiridos de

Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). El inhibidor de JNK 1,9-pyrazoloanthrone

(SP600125), p38 inhibidor 4 - (4-fluorofenil) -2 - (4-metilsulfinilfenil) -

5 - (4-piridil) 1H-imidazol (SB203580), 1,4 inhibidor ERK -

diamino-2 ,3-diciano-1 ,4-bis (metiltio) butadieno (U0126), IKK

inhibidor II, proteína quinasa C inhibidor, 2 - [1-3 - (aminopropil) indol-3-il] -

3 - (1-metil-1H-indol-3-il) maleimida (Ro 31-9549), 12 - (2-cianoetil) -

6,7,12,13-tetrahidro-13-metil-5-oxo-5H-indolo (2,3-a) pirrolo (3,4-c) -

carbazol (Ir ¨ 6976), y el inhibidor del proteasoma N-benzoyloxycarbonyl

(Z)-Leu-Leu-leucinal (MG132) fueron de Calbiochem (La Jolla, CA).

Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para transferencias Western: anti-fosfo-

JNK (Invitrogen, Carlsbad, CA), anti-MKP-1, y anti-SKP-2 (de Santa

Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), anti-fosfo-MKK7 (Abcam,

Cambridge, MA), anti-JNK1 (BD Biosciences, San Jose, CA), y

anti-?-tubulina (Sigma-Aldrich). Dihydroethidium (DHE) se adquirió

de Invitrogen. El plásmido pRSV-LacZ se ha descrito previamente

(Lin et al., 1999). El plásmido MKP-1EE fue construido por

PCR mutagénesis dirigida utilizando el plásmido pLenti6/V5-MKP-1 como un

plantilla (un regalo del doctor C. Chen, Albany Medical College, Albany, NY)

para generar una MKP-1 mutante, en el que los dos residuos de serina en

posiciones 359 y 364 se sustituya por residuos de ácido glutámico (Liu et

al., 2009). La PCR fueron 5?-TtggatcccATGGTCATGGAAGTGGGCAC-

3? y 5?-ttctcgagTCAGCAGCTGGGTTCGGTCGTAATGGGTTCCTGAAGGTAGCTCGCGCAC-

3?. Los productos de PCR

se digirió con BamHI / XhoI y se clonó en el 3.1/HisB pcDNA

vector (Invitrogen), resultando en pcDNA-MKP-1EE. La construcción fue

verificada por secuenciación del ADN.

Cultivo celular, transfección, y tinción con X-Gal. El ser humano

líneas celulares de cáncer de pulmón H460 y A549 se obtuvieron de la American

Type Culture Collection (Manassas, VA) y se cultivaron en RPMI 1640

con suero fetal bovino al 10%, 1 mM de glutamato, 100 unidades / ml de penicilina,

y 100? g / ml de estreptomicina. Las células cultivadas en placas de 12 pocillos fueron

transfectadas con pcDNA-MKP-1EE con FuGENE HD de acuerdo a

de instrucciones del fabricante (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN).

Veinticuatro horas después de la transfección, las células fueron tratadas como se indica

en cada una leyenda de la figura. Para la tinción X-gal, las células se cotransfectaron

con pRSV-LacZ y pcDNA-MKP-1EE o vector vacío con Fu-

Gen de la EH. Veinticuatro horas tras la transfección, las células eran

tratada como se indica en cada leyenda de la figura. Las células fueron lavadas con

salina tamponada con fosfato una vez y se fijaron en paraformaldehído al 1%

y se tiñeron como se ha descrito (Lin et al., 1999). Las células se visualizaron y

fotografiaron bajo un microscopio.

La citotoxicidad de ensayo. La citotoxicidad se determinó usando un

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