Medios de cultivo Streptomyces.

Medios óptimos para el microorganismo streptomyces

Medio mínimo: S04(NH4>2.05%, P04HK2 0,05%, SO4Mg.7H20 0,02%, SO4Ee.7H20 0,001%, pH 7,2.Tras esterilizar, se añade Manitol estéril hasta 0,5%.

Para medio sólido, se añadió agar hasta 2,2%.

R2YE o RS: Sacarosa 10,3%, S04K2 0,025%, Cl2Mg.6H20 1,012%, glucosa 1%, casaminoácidos) 0,01%, extracto de levadura 0,5% tampón TES 0,573%, elementos traza 0,2%. Ajustar a pH 7,3, añadir agar hasta 2,2% y esterilizar.

DNA: DNE, glucosa 0,5%, agar 1.5%. Esterilizar y añadir (N03)2Ca hasta 0,8mM y SO4Mg hasta 1mM.

SNA: DNB con agar al 0,6%.

YEME: Extracto de levadura 0,3%, extracto de malta 0,3%, bactopeptona 0,5%, glucosa 1% y Sacarosa 10,3%. Esterilizar y completar con Cl2Ng.6H20 hasta 5mM.

Para la preparación de protoplastos añadir, además, glicina hasta 0,5%.

Medio de cultivo Y Selección

Se parte de un cultivo de 25m1 de YEME crecido a 30OC durante 48 horas. Tras recoger el micelio por filtración se lava con sacarosa al 10%. Posteriormente se re suspende con el tampón de lisis alcalina con lisozima (2-4 mg/ml), incubando a 37oC durante 40 minutos. Estas células se lisan en presencia de SDS con una concentración final de 1%. Se extraen con fenol: cloroformo neutro (50:50 con un OH-quinoleína al 0.1% y neutralizando con Tris-HCl 50mM pH8. Las extracciones se suceden hasta que no se observan interface. Posteriormente se precipita con 2,2 volúmenes de etanol al 100% y 1/10 volumen de AcNO3 3M. Después de dos lavadas con etanol 75%, se disuelve en TE con una concentración de RNAsa de 50ug /ml, incubándose a 37oC durante 60 minutos para digerir el RNA. La fase acuosa se vuelve a extraer con fenol: cloroformo neutro y se precipita con etanol 100% disolviendo finalmente en TE. La concentración de las soluciones de DNA se determina por la medida de la densidad óptica a 260 nm en cubetas de cuarzo de 1 mm y considerando que 1 unidad de D.O. se corresponde con una concentración de DNA de 50ug/ml. La pureza de la preparación se estima midiendo en las mismas condiciones pero a 280 nm y determinando la relación DO 260/280, siendo valores aceptables entre 1,65 y 1,85.

En el caso de Streptomyces las células se re suspenden en 5ml del tampón de lisis; este tampón contiene, además, lisozima (2-4 mg/ml). Se incuban a 37oC durante unos 30 minutos, para digerir la pared celular. Posteriormente se lisan las células añadiendo 3 ml de solución de lisis alcalina previamente calentada a 60oC, e incubando 10 minutos a 70oC en el caso de plásmidos pequeños de Streptomyces. Si los plásmidos de streptomyces son de gran tamaño, es necesario un tratamiento más suave, que consiste en una incubación a 50oC hasta que se observa una lisis total, generalmente unos 30 minutos.

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