Metodología Identificación de lípidos mediante tinción simple

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Metodología

Identificación de lípidos mediante tinción simple

Materiales:

• 3 tubos de ensayo
• Gradilla
• Pipeta Pasteur
• Reactivo sudan III
• Aceite
• huevo

Procedimiento

• Verter cinco gotas de aceite en un tubo de ensayo (muestra control), en otro agregar cinco gotas de mezcla de yema de huevo (muestra problema), en un tercero verter cinco gotas agua (muestra control negativo).
• Añadir veinte gotas de reactivo sudan III.a cada tubo de ensayo.
• Dejar reposar durante diez minutos, luego observar

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Extracción de lípidos totales

Materiales

• Tubos eppendorf 2ml
• Huevo
• Cloroformo
• Pipeta Pasteur
• Micropipeta o tubos capilares
• Vortex
• Centrifuga

Procedimiento

• En un tubo eppendorf añadir cuatro gotas de la mezcla de huevo, luego agregar ocho gotas de una solución de metanol: cloroformo (2:1), llevar al vortex durante 3 minutos para homogenizar la mezcla, dejar reposar por dos minutos.

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• En el tubo añadir ocho gotas de la mezcla de cloroformo: agua (1:1), luego llevar la muestra al vortex por un minuto más para mezclar vigorosamente.
• Centrifugar durante diez minutos el tubo eppendorf a 10.000 rpm.
• Rotular la muestra y reservar para la siguiente etapa del laboratorio.

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Separación de lípidos y carbohidratos mediante cromatografía de capa fina (TCL)

Materiales:

• Regla
• lápiz mina o grafito
• Placa Silica-gel
• Cloroformo
• Metanol
• Vaso precipitado

Procedimiento:

• Las placas previo a su uso se deben activar en una estufa de laboratorio a 120° C durante una hora.
• Preparar bajo campana una mezcla de cloroformo: metanol: agua (65:35:4), solvente de corrida
• Con un lápiz  y una regla hacer tres marcas a 0,5 cm de los bordes de la placa, para determinar el lugar de siembra
• Para el sembrado utilizar la muestra extraída en el procedimiento anterior (muestra problema), además de aceite (control positivo) y agua (control negativo)
• Sembrar una pequeña gota de cada gota utilizando un tubo capilar o una micropipeta, debajo del borde de las marcas previamente realizadas.
• Colocar la placa de manera vertical en el solvente de corrida (el nivel de este debe estar por debajo de la siembra), con el sembrado hacia debajo de manera que este quede sumergido en la solución.

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• Tapar el vaso y dejar que el solvente ascienda a través de la placa hasta llegar al borde superior, sacar la placa y dejar secar horizontalmente.

• Bajo campana colocar la placa en un frasco que contenga yodo sólido, el vapor provocara la tinción de los lípidos.
• Revelar a través de una cámara con luz ultravioleta

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