Observaciones de bacterias tinciones simples y compuestas

Observaciones de bacterias tinciones simples y compuestas.

Jesus Andres Ortiz

Julian Hernandez

Angela

Monica

Introducción

Las técnicas usadas en microbiología para hacer los diferentes montajes, dependiendo a la tarea que se va a realizar, Entonces llegamos a preparaciones húmedas y sólidas, dependiendo su composición que permiten observar el reconocimiento y  al uso que se le destina  el comportamiento de los organismos, con técnicas de tinción con colorantes, que nos da a observar su estructura y formas. Las tinciones se pueden dividir, en tres simples, diferenciales y especiales.

La tinción simple se usa un solo colorante acido (fucsina acida, tinta china, naranja G o la eosina) o uno básico ( la tioninca, safranina, azul de toluidina, el azul de metileno o la hematoxilina) usados generalmente para identificar estructuras y formas específicas. Las tinciones se pueden dividir en tres: simples diferenciales y especiales.

La tinción simple se usa en un colorante acido (fuscina acida, tinta china, naranja G o la eosina, o un básico ( la tioninca, safranina, azul de toluidina, el azul demetileno o la hemotoxilina) usados generalmente ara identificar estructuras y agrupaciones. Estos colorantes son sales, las cuales están provistos de iones cargados positivamente como negativa, en donde los cromatóforos positivo se encuentra en el colorante y el cromatóforo negativo se encuentra en colorante acido.

En la tinción diferencial se emplean más de dos colorantes donde se identifica  formas morfológicas, tamaños, agrupaciones, clasificación. Según su pared celular, la tinción Gram se dividen en Gram negativas sufren un procesos de decoloración debido a su pared celular, mientras que las bacterias Gram positivas mantiene el colorante cristal violeta en su interior quedando de color violeta.

Otra tinción diferencia es la de alcohol acido resístente  (Ziehl Neelsen) se emplean dos colorantes. Esta tinción se usa para bacterias que no se pueden teñir con la tinción de gram, La importancia de esta tecninca se relaciona con donde la pared celular, al se una pared con hartos contenidos micolicos o ceras que le confieren su trabajo.

La tincion especial como la de Schaeffer – Fulton utilizada para la identificación de endosporas, que con un colorante primario verde de malaquita permite identificar estructuras como las endosporas.

En general las tecnincas de preparación usadas en el laboratorio son de vital importancia para identificar estructuras, características morfológicas y de funcionamiento utilizando esta información y hací poder ganar la batallas aquellos organismos que no plazcan nuestro bienestar

Materiales y métodos

1. Montaje en fresco o húmedo.
2. Muestra en un medio liquido:

Como primer paso, tomamos el asa y la esterilizamos calentándola en un mechero hasta que tomara un color rojo vivo, la dejábamos enfriar y prodeciamos a tomar  ponerle el cubre objetos y luego montar la placa en el microscopio y observarla a 100x; la preparación en fresco permite ver solo algunos microrganismos que no se pueden observar con este método. Este método permite observar el microrganismo de forma mas sencilla y económica y de la manera mas directa, conocida hasta el momento.

2 Tinciones diferenciales

Tinción de gram: Los principios de la tinción de Gram están basados en las características de la pared celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada microrganismo. La pared celular de las bacterias Gram negativas esta contituida por una capa fina de peptidoglicano y una membrana celular externa, mientras que las bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular externa; así pues, la composición química y el contenido de peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram negativas y Gram positivas explica y determina las características de tinción.

Gram positiva: esta tinción la realizamos con escherilla ecoli y bacillus, como el primer paso esterilizamos el asa y tomamos una manera de cultivo de estafilococos, la esparcimos por el portaobjetos d forma circular, la dejamos secar a temperatura ambiente y la fijamos flameandola al calor pasándola 2 y 3 veces, luego la pusimos en un soporte en un lavaplatos y le agregamos cristal violeta sobre toda la muestra y lo dejamos durante 1 minuto lavamos con agua para quitar el exceso de colorante teniendo la precaucion de no hacer caer el porta objetos y agreandole agua lentamente para que no se fuera a lavar la bacteria,luego aplicamos lugol duante un minuto ylo lavamos con agua, luego le aplicamos alcohol cetona durante 30 segundos y lavamos con agua, luego adicionamos fucsina durante 1 minuto y lavamos con agua, luego adicionamos fucsina durante 1 minuto y lavamos con agua y la pondremos a 100 y asi poder ver que los estafilococos se veia de un color morado claror.

Gram Negativa: esta tinción la realizamos con E.coli y Pseudomona, como primer paso aesterilizar el asa y tomamos una muestra del cultivo, la esparcimos por el portaobjetos de forma circular, y la dejamos secar a temperatura ambiente , y asi fijarla flamenadola al calor pasándola 2 – 3 veces. Luego la pusimos en un soporte en un lavaplatos y le agregamos cristal violeta sobre toda la muestra y lo dejamos durante 1 minuto, lavamos con agua para quitar el exceso de colorante teniendo la precaucion de no correr la muestra el portaobjetos y agregándole agua lentamente, luego aplicamos lugol durante un minuto y lo lavamos con agua, luego le aplicamo alcohol cetona durante 30 segundos y lavamos con agua, luego adicionamos fucsina durte 1 minuto y lavamos con agua y la pusimos a secar a temperatura ambiente, después observamos a 4x a 10 x y a 100x  y observamos que la bacteria era de color violeta. Con puntos rosados.

Tincion de Zielh neelsen (AAR)

• Tinción de Zielh neelsen (AAR): Esta tinción se realizó con micobacteria, se tomó  de un caldo de micobacteria mezclada con otro microorganismo(no identificado), se esterilizo el asa con el mechero y procedimos a extraer  una muestra del caldo, tuvimos la precaución de no hablar ni hacer ningún movimiento brusco debido a que las micobacterias producen tuberculosis y se transmite mediante el aire la pusimos en un soporte que estaba sobre un lava platos, añadimos fucsina fenicada sobre toda la muestra y la dejamos durante 7 minutos, luego de que el tiempo fue cumplido lavamos con bastante agua teniendo la precaución de no lavar el extendido, seguido de esto le aplicamos alcohol acido durante 30 segundos a un minuto y procedimos a lavar como último paso añadimos azul de metileno durante un minuto y lavamos. Esta técnica es importante debido a que la tinción de Z-N fuerza la penetración de la fucsina básica en la pared celular mediante la acción combinada del fenol y el calor, que aumentan la fluidez de la capa de ácidos micólicos: el calor “derrite” el componente ceroso y el fenol actúa a modo de disolvente, permitiendo el paso del colorante básico que se une a los ácidos micólicos con carga negativa. Cuando cesa la aplicación de calor y/o se elimina el exceso de fenol mediante un lavado con agua, la pared recupera su consistencia cerosa, pero las moléculas de fucsina quedan atrapadas en su espesor. Con la coloración de Ziehl Neelsen se observan como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo fucsia, destacándose claramente contra el fondo azul.

3 Tinciones especiales

• Tincion de Schearfer – Fulton para endosporas: Estas tinción se realizo con ______ como primer paso es esterilizamos el asa y procedimos a tomar una muestra del cultivo, la esparcimos por el portaobjetos, pusimos la placa en un soporte en el lavaplatos y le aplicamos verde de malaquita (que cubriera todo el extendido), luego pasábamos el mechero por debajo de la muestra repetidas veces de derecha a izquierda durante 8 minutos sin que la placa expulsara vapores, cuando comenzó a expulsar vapores dejábamos de pasar el mechero, luego de que se cumpliera el tiempo, procedimos a lavar con agua para quitar el exceso de colorante, luego aplicamos safranina durante un minuto y lavamos con agua, sacudimos la placa en una toalla de papel para quitar el exceso de agua y la dejamos secar con aire, después de seca la montamos en el microscopio y la observamos a 100x, permite la observación de le endospora bacteriana la cual está  presente en algunos géneros bacterianos como: Bacillus, Clostridium y Sporosarcinas. El esporo es de gran importancia porque resiste altas temperatura y factores adversos del ambiente. La posición y tamaño que presente la endospora dentro de la célula es un padrón de referencia para cada especie. En el género Clostridium, la endospora presenta generalmente un diámetro mayor al de la célula vegetativa, ya en el género Bacillus, la espora puede ser del tamaño menor o igual, y ubicada en posición central en la célula vegetativa. Para colorear la endospora se utiliza la tinción de Schearffer-Fulton, aquí se aplica el colorante verde de malaquita como colorante primario, el cual se calienta hasta la emisión de los primeros vapores, aquí el calor ayuda a que el colorante atraviese la pared impermeable de la endospora. Luego se lava el preparado para eliminar el exceso del colorante, quedando solo coloreadas las endosporas, posteriormente se adiciona la safranina, que es el colorante de contraste que tiñe las células diferentes de las endosporas. Así las endosporas aparecen verdes dentro de células rojas o rosadas, con este método se puede determinar la ubicación intracelular de la misma (terminal, subterminal o central).
• Tinción negativa: esta muestra se realizó con la bacteria _______ spp. tomamos el asa y la esterilizamos, y tomamos una muestra del cultivo inoculo, la pusimos en el portaobjetos con una gota de agua destilada, lo mezclamos  y le aplicamos una gota de colorante acido (tinta china) sobre la emulsión, extendimos el cultivo teñido por el portaobjetos hasta obtener una capa fina, la dejamos secar a temperatura ambiente y la observamos en el microscopio a 100x.

Resultados y discusión

En el laboratorio se llevaron a cabo cinco  montajes de  los cuales cuatro se hicieron con coloraciones, mientras que uno se hizo sin ningún tipo de colorante. Las  preparaciones que se hicieron  con colorantes se pueden clasificar como tinciones tinciones diferenciales (Gram positiva, Gram negativa, Zielh Nielsen)  y tinciones especiales (Scheaffer-Fulton y tinción negativa).

Preparación en fresco:

 En esta técnica no se utiliza ningún tipo de colorante. El montaje se hace directo y  húmedo, donde las muestras se extienden directamente sobre la superficie de un portaobjetos para su observación. Las preparaciones en fresco se utilizan para visualizar el movimiento de las bacterias y por ello debo hacerse con organismos vivos.

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