PRÁCTICA 3. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO MICROBIOLÓGICO Y ESTERILIZACIÓN

PRÁCTICA 3.

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO MICROBIOLÓGICO Y ESTERILIZACIÓN.

Introducción.

Medios de cultivo.

        La supervivencia y crecimiento de los microorganismos depende de la disponibilidad de nutrientes y de condiciones ambientales favorables para el crecimiento. En el laboratorio, las preparaciones de nutrientes que son utilizadas para cultivar microorganismos son llamadas  medios. Se utilizan tres formas físicas de ellos: medio líquido o caldo; medio semisólido; y medio sólido. La principal diferencia entre estos medios es que el sólido y el semisólido contienen un agente solidificante (usualmente agar), mientras que el medio líquido no lo contiene. Los medio líquidos, tales como el caldo nutritivo, el caldo soya tripticasa, o el caldo de infusión cerebro-corazón, pueden ser utilizados para propagar una gran cantidad de microorganismos en estudios de fermentación y para varias pruebas bioquímicas. El medio semisólido también puede ser utilizado en estudios de fermentación, para determinar la motilidad bacteriana, y para promover el crecimiento anaerobio. Los medios sólidos, tales como el agar nutritivo o el agar sangre, son usados (1) para el crecimiento de los microorganismos en superficie con el fin de observar la apariencia colonial, (2) para aislamiento de cultivos puros, (3) para almacén de cultivos, y (4) para observar reacciones bioquímicas específicas.

        Mientras se encuentra en estado líquido, el medio sólido puede ser vertido en un tubo de ensaye o en una caja petri. Si el tubo con medio es dejado solidificar en una posición inclinada, el tubo se denomina agar inclinado; si se deja inclinar en posición vertical, el tubo se denomina tubo con agar profundo; y si el agar es vertido en una caja petri, la caja se denomina agar en placa. Usualmente en una caja petri se vierten de 15 a 16 mL de medio.

Los microorganismos pueden ser cultivados usando dos diferentes tipos de medios. Los medio químicamente definidos o sintéticos están compuestos de cantidades conocidas de compuestos químicos puros. Tales medios son usados a menudo en el cultivo de microorganismos autótrofos tales como algas o heterótrofos no meticulosos. En ejercicios rutinarios de laboratorios de bacteriología se utilizan medios complejos o no sintéticos. Éstos están compuestos de materiales complejos ricos en vitaminas y nutrientes. Tres de los componentes más comúnmente utilizados son el extracto de carne, el extracto de levadura y las peptonas.

La preparación de medios a partir de productos comerciales deshidratados es simple y sencilla. Cada bote de medio deshidratado tiene en su etiqueta las instrucciones para su preparación. Por ejemplo, para preparar un litro de caldo soya tripticasa se suspenden 30 g del medio deshidratado en 1000 mL de agua destilada; se mezcla minuciosamente en un matraz Erlenmeyer de 2 litros (siempre use un matraz del doble del volumen de medio que se está preparando), distribuya y esterilice de 15 a 20 minutos  a 1210C (15 lbs de presión).

Si el medio carece de agar, el polvo normalmente se disolverá sin calentar. Pero si contiene agar, deberá calentarse el medio hasta que comience a hervir para completar la disolución del agar. Para cada tipo de medio existen instrucciones específicas de calentamiento.

Para el cultivo en tubos usualmente se utilizan tubos bacteriológicos de 18 x 150 mm, 16 x 125 mm o 13x 100 mm. Estos tubos deben ser tapados para mantener el medio estéril. Esto puede lograrse utilizando tapones de algodón, tapones de goma, o tapones de plástico o metal. Todos estos tipo de tapón mantienen los cultivos libres de contaminación pero permiten al aire entrar al tubo y, al mismo tiempo, minimizan la evaporación. En ocasiones es deseable utilizar tubos con tapón de rosca. Esto es especialmente útil cuando los cultivos, tales como el caso de los inclinados, son sellados y almacenados por largos periodos.

El caldo de cultivo puede ser distribuido con una pipeta automática, una jeringa automática, o una pipeta normal. Se puede también pipetear el volumen adecuado de caldo o agar en un tubo de cultivo y luego verter aproximadamente el mismo volumen  de medio (usando el

Después de la esterilización de tubos inclinados, los tubos son removidos del autoclave  mientras el agar aún está fundido y colocados cuidadosamente  en una mesa con una pedazo de madera, un tubo al vacío, o un pedazo de metal que eleve el extremo tapado de los tubos. Algunas gradillas están específicamente diseñadas para esto. Los tubos se dejan entonces en reposo hasta que el agar se enfríe y solidifique. Los tubos inclinados deben almacenarse en posición vertical.

Los tubos con agar profundo pueden ser almacenados después de su esterilización y usarse para preparar cajas petri cuando sea necesario. Algunos de estos agares pueden ser almacenados a temperatura ambiente por varios días antes de ser usados. Si se requieren periodos más largos de almacenamiento, los tubos deben ser colocados en refrigeración para prevenir la deshidratación del agar. Cuando se necesitan las cajas petri, los agares profundos son fundidos ya sea colocándolos a baño maría o colocándolos en un autoclave a 1210C por 30 a 60 segundos y liberando luego el vapor lentamente. Después de que el agar se ha fundido los tubos son transferidos a un baño maría a 48-500C y mantenidos así por al menos 5 a 10 minutos antes de su uso. El agar debe ser enfriado  a cerca de 500C antes de ser usado para minimizar la cantidad de vapor de condensación sobre la tapa de la caja petri después de que el agar ha sido vertido. El agar no solidificará hasta que la temperatura baje a 420C. Cuando los tubos han alcanzado los 500C, se toma uno del baño maría y el exterior es secado con una toalla de papel. Se remueve su tapón y la parte superior se flamea levemente usando la flama de un mechero bunsen. El agar es inmediatamente vertido en una caja petri estéril y seca mientras la tapa se mantiene cuidadosamente sobre parte inferior de la caja para prevenir la contaminación. La tapa se coloca luego, permitiendo que el agar se enfríe y solidifique, almacenando la caja petri en posición invertida. Cuando se almacenan cajas petri no deben apilarse más de tres, de preferencia utilice un dispositivo especial de almacenamiento de cajas petri.

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