“Preparación de medios de cultivo y esterilización y aislamiento e inoculación de microorganismos”

Universidad Autónoma de Nuevo León[pic 1][pic 2]

Facultad de Ciencias Químicas

Licenciatura en Química Industrial

Bioquímica Microbiana

Reporte 3

“Preparación de medios de cultivo y esterilización y aislamiento e inoculación de microorganismos”

Equipo 3

Brenda Lucia Mata Álvarez   1581605

Juan Alberto Reyna Torres   1586539

Maestros:

Dr. Martin Rosas Castor

Dra. María Teresa Garza

San Nicolás de los Garza, Nuevo León

A 2 de Octubre de 2016.

• OBJETIVOS

• Preparar distintos medios de cultivo y esterilizarlos.
• Realizar el aislamiento de diversos microorganismos mediante el empleo  de los métodos de estría cruzada e inoculación y transferencia.

• INTRODUCCIÓN

Los medios de cultivo, tienen como objeto proporcionar a los microorganismos los requerimientos nutricionales, fuera de su hábitat normal; necesario para su aislamiento y cultivo. Los medios pueden clasificarse según su estado físico en sólidos, líquidos y semisólidos; los primeros contienen agar y se necesita calor para disolverlos, los segundos no contienen agar y generalmente se disuelven a temperatura ambiente. Los medios de cultivo también se clasifican según su composición en: medios simples, selectivos y enriquecidos1.

Respecto a la composición química de los medios de cultivo, estos pueden ser:

1. Sintéticos: cuando se conoce la composición química y la concentración de sus constituyentes; ya que para su fabricación se emplean productos químicos relativamente puros, estos se seleccionan de acuerdo con las necesidades nutricionales de cada microrganismo heterótrofo requiere de una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, y sales inorgánicas; quizás algunos más exigentes requieren de vitaminas, purinas y aminoácidos1.
2. No sintéticos: son aquellos que no se conoce su composición química exacta, ya que la mayoría de ellos son digeridos ácidos o enzimáticos de diversos tejidos: vegetales, carnes, caseína y células de levaduras que pueden proporcionar fuentes ricas de polipéptidos, aminoácidos, sales minerales o vitaminas. Ejemplos de estos serían: peptona, triptona, extracto de levadura, hidrolizado de caseína, etc1

A pesar de estos digeridos sostienen carbohidratos en cierta proporción, se acostumbra suplementarlos con un azúcar adicional1.

Para trabajar con cultivos libres de cargas microbianas sin control es necesario esterilizar los medios preparados, la esterilización significa tener cero microorganismos. Se debe tener en cuenta que desinfectar no es esterilizar. Existen distintos métodos de esterilización los cuales son entre otros: calor (seco o húmedo), filtración, radiaciones ionizantes y agentes químicos1.

En esta práctica se realizara la preparación de dos medios de cultivo que son el agar nutritivo (AN) y el agar patata dextrosa (PDA), así como también se llevara a cabo la esterilización del material a utilizar mediante calor húmedo a una presión de 15 lb/in2 y una temperatura de 121°C por un tiempo de 15 minutos1.

Mientras tanto en los estudios microbiológicos es necesario aislar los microorganismos para analizar con detalle sus características morfológicas como bioquímicas, energéticas, etc. y de ahí poder determinar su utilidad en distintas áreas. Para esto se utilizan técnicas de aislamiento las cuales no permitirían obtener en particular un microorganismo y analizar sus características individuales. Existen diversos métodos en la práctica para aislar microorganismos, dos de ellos son el método de estría cruzada y el de inoculación y transferencia, ambos se basan en la realización de diluciones de cada muestra para sembrar en medio selectivo adecuado, identificar la colonia típica del microrganismo la cual debe estar lo más aislada posible de otras y se procede a transferir el material de la colonia a un nuevo medio, incubar y obtener de esta manera un cultivo puro1.

El método de inoculación y transferencia difiere de la siembra por estría en que el medio de Agar es inoculado mientras esta líquido, en forma tal que las colonias se desarrollan en todo el medio, no solamente en la superficie. El primer problema que debe resolverse en este método, es la obtención de concentraciones apropiadas de células bacterianas, debe evitarse la obtención de placas con una gran cantidad de colonia, como placas sin ninguna colonia, las cuales no serían útiles para nuestros fines. Por lo cual deben prepararse varias diluciones de la muestra1.

La utilización de una asada de la muestra para inocular el primer tubo, proporciona por lo general placas con un número apropiado de colonias1.

• MARCO TEÓRICO

Un cultivo es cualquier preparación en que ha habido crecimiento artificial de microorganismos. Suele emplearse el término para denotar el desarrollo artificial de microorganismos. Es prácticamente imposible encontrar cultivos puros fuera del laboratorio, esto es debido a la facilidad con la que los microorganismos pueden asociarse1.

Un medio de cultivo es un sustrato o solución de nutrientes en que se cultivan los microorganimos en el laboratorio. Los microorganismos necesitan diferentes materiales nutritivos y se emplean diferentes medios de cultivo según las necesidades1.

El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. La composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente.  Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales  y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer2.

Existen medios cuya composición permite el crecimiento de:

1. Un gran número de especies (agar nutritivo, caldo ordinario, agar de Sabouraud)2.
2. Determinados microorganismos (impidiendo el desarrollo de otros), son los denominados medios selectivos2.
3. Otros en cambio, se desarrollan para el estudio de determinadas pruebas fisiológicas o test bioquímicos (utilización de citratos, acidificación a partir de azúcares, etc.)2.

Los medios de cultivo poseen una serie de componentes:

1. Indispensables: Entre los primeros se incluye el agua, nutrientes orgánicos (hidratos de carbono, aminoácidos, vitaminas, etc) y nutrientes inorgánicos (P, Fe, N, Mg, S, etc)2.
2. Alternativos: sustancias isosmotizantes (NaCl), agente solidifícate (agar-agar), tampones, indicador de pH, etc2.

Método de siembra por estría en placa

 Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una placa Petri (a las placas Petri también se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales. A continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola célula, no podemos asegurarlo. Quizás, dos células quedaron depositadas tan juntas que han originado una única colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, serán, casi con toda seguridad, cultivos axénicos 3.

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