Práctica de curvas tipo

Objetivos: Obtener una curva de calibración, mediante la cual se puedan transformar las lecturas de absorbancia obtenidas en micro moles y así obtener la actividad de la enzima invertasa

Introducción

Una curva de calibración es la representación gráfica de una señal que se mide en función de la concentración de un analito. El método se basa en la relación proporcional entre la concentración y una determinada señal analítica (propiedad). La relación concentración-señal se suele representar en una grafica a la que se le conoce como curva de calibración. Las señales más utilizadas son aquellas cuya relación con la concentración es lineal, al menos en el rango de trabajo. Por ejemplo, una de las propiedades mas utilizadas es la absorbancia (absorción lumínica) que suele mantener una relación lineal con la concentración de solutos en disoluciones.

Al ser una relación lineal, se puede representar mediante una recta, de ahí que este tipo especifica de curva de calibración se conozca también como recta de calibración. Esta es importante ya que para demostrar la linealidad se requieren cumplir ciertos criterios de aceptación en la que estadísticamente se puede justificar esa linealidad; para ello se necesita calcular:

• La pendiente (m)
• La ordenada al origen (b)
• El coeficiente de determinación (r2)

Resultados:

[pic 1]

Análisis y discusión de resultados:  

La reacción que ocurre entre la enzima invertasa con la sacarosa es una hidrólisis, dando como productos a la D-glucosa y a la D-fructosa. Los productos de esta reacción son azúcares reductores.

Imagen 1.0, Reacción de hidrolisis de la sacarosa por la enzima invertasa, formando glucosa y fructosa cíclica.[pic 2]

Los azúcares cuando se encuentran en solución acuosa se encuentran en equilibrio entre sus formas cíclicas y sus formas de cadena abierta, esto se debe a que, en medio acuoso, los grupos carbonilos de los azúcares forman hemicetales y hemiacetales, los cuales son inestables por lo que se regeneran en su forma de cadena abierta. Por ello, en esta práctica consideraremos que los azúcares se encuentran en su forma de cadena abierta.

El 3,5-DNS es un reactivo con coloración amarilla el cual es empleado en bioquímica para identificar la presencia de azúcares reductores, esto se debe a que se comporta como agente oxidante el cual reaccionará con el azúcar reductor. Al reducirse el 3,5-DNS se forma el ácido 3-amino-5-nitrosalicílico el cual absorbe la luz en una longitud de onda de 540 nm, lo que le otorga una coloración rojiza. La cantidad de azúcar reductor en el medio determinará la intensidad de esta coloración, pues mientras menor sea la cantidad de azúcar, se formará menos ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, por el contrario, mientras más cantidad de azúcar haya en el medio, se formará más.

[pic 3]

Imagen 2.0. Reacción general del azúcar reductor (D-glucosa) con el ácido 3,5-dinitrosalicílico (amarillo) formando como productos el ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (rojo) y el azúcar oxidado (ácido D-glucónico)

La razón por la cual se debe adicionar regulador de acetatos en los tubos es que, como se está realizando una serie de pruebas para determinar la variación en la velocidad de la reacción de la cinética enzimática, se deben preservar las mismas condiciones de reacción en todas las pruebas, sin embargo, este reactivo no influye en los resultados de esta prueba pues no afecta la concentración de azúcares ni el reactivo 3,5-DNS.

Durante las pruebas con diferentes concentraciones de azúcares reductores, se puede ver cómo afecta a la reacción de estos con el ácido 3,5-dinitrosalicílico, pues, en el tubo testigo, al cual se le agregaron 0.5 ml de sacarosa 0.2M, 0.5 ml de regulador de acetatos 0.5 M, 1 ml de agua y 0.5 ml de 3,5-DNS, posteriormente se puso a baño maría a 92 °C durante 5 minutos, con la finalidad de desarrollar la reacción de coloración, después se colocó en baño de hielo y se diluyó en 2 ml de agua destilada, con la finalidad de detener la reacción de coloración; pudimos observar que la coloración amarilla se preservó durante todo el proceso, lo que indica que no hubo ninguna reacción, analizando el contenido del tubo testigo nos percatamos que no había ningún azúcar reductor. Esto se debe a que no se hidrolizó la sacarosa para formar glucosa y fructosa, por lo que la reacción nunca inició.

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