Practica 4 Tinción de Ziehl Neelsen

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                                           Tinción de Ziehl Neelsen

• El alumno llevará a cabo la tinción de Ziehl Neelsen en una muestra de expectoración para la observación de bacilos ácido-alcohol resistentes. [pic 3]

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La tinción de Ziehl Neelsen es una técnica que se usa para la coloración de microorganismos para la identificación de patógenos.

Esta tinción se emplea para bacteria que son difíciles de teñir y no se logran teñir con colorantes convencionales, que no lograr penetrar de manera fácil el interior de estas bacterias. Para que se logren penetrar el interior de estas células, usaremos colorantes altamente concentrados y con calor para facilitar eso.

Si aparece coloración roja es que hay presencia de micobacterias en la muestra. Si la coloración que aparece en la muestra es azul, es que hay otro tipo de bacterias en la muestra. Trabajando con esta técnica se podrá identificar bacterias como la causante de la tuberculosis o algunas otras que llegan a tener una pared que no se les permitirá teñirse convencionalmente.

La coloración clásica de Ziehl-Nielsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste. Debido a esto, está que está muy influenciado con la enfermedad de tuberculosis.[pic 6]

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Preparación del frotis

1. Preparar un frotis a partir de la muestra, con un lápiz graso trazar una línea divisoria de un tercio en el portaobjetos la cual se ocupará para escribir el número de muestra, nombre de paciente y procedencia, el resto de la superficie se utilizará para la muestra.
2. Destapar el envase de la muestra colocándolo junto al portaobjetos, se recomienda hacerlo sobre un papel negro,
3. Tomar un aplicador de madera y partirlo en dos porciones, una de las mitades entre el pulgar y el índice de cada mano y con los extremos irregulares se selecciona la partícula útil de muestra, constituida por la parte purulenta, sanguinolenta o mas densa. Se recomienda enrollar la muestra en una de las mitades del aplicador con ayuda de la otra.
4. Colocar la muestra sobre el portaobjetos cerca de la línea divisoria y extender la con e aplicador, mediante movimientos circulares hasta lograr un grosor homogéneo. El resto de la muestra regresarla al envase con el mismo aplicador. Loa aplicadores se desechan en un recipiente que contenga solución de cloruro de benzalkonio.
5. Secar al aire a temperatura ambiente, fijar al calor y cubrir la zona donde se encuentra la muestra con un pedazo de papel filtro.
6. Colocar en las varillas para iniciar su tinción, se recomienda inclinarlas un poco para evitar el contacto del colorante con el etiquetado del frotis.

Tinción Ziehl Neelsen

1. Cubrir el frotis con el colorante carbol-fucsia y calentar por debajo del mismo utilizando flama pequeña de un mechero de alcohol. Evitando la formación de vapores blancos visibles, cuando esto suceda retirar el mechero y aplicar calor nuevamente cuando los vapores desaparezcan, Repetir durante 3 a 5 minutos, evitar que seque añadiendo más colorante conforme se evapora.
2. Lavar bajo el chorro de agua con poca presión.[pic 16]
3. Cubrir el frotis con la solución de alcohol-ácido hasta lograr decoloración completa del frotis. Lavar con agua igual que antes, si el portaobjetos está de color rosa aplicar nuevamente el alcohol ácido y mantener durante 1 o 3 minutos más y volver a enjuagar.
4. Cubrir con el colorante de contraste azul de metileno durante 60 segundos.
5. Lavar con agua y dejar secar al aire, una vez seco observar con el objetivo de inmersión.
6. Los BAAR se observan de color fucsina y el fondo de azul.

Observación microscópica

1. Se realiza la observación microscópica en cada campo del microscopio siguiendo las manecillas del reloj.
2. Realizando el recorrido del portaobjetos como se observa a continuación.

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Como resultados tenemos el que mostramos aquí abajo siendo unos resultados dados por la maestra, tenemos una imagen dada por el microscopio al 100x donde tenemos una tinción en color azul, siendo bacilos sin agrupación y sin tener una forma definida, con la imagen contaremos en diferentes campos con movimientos rectos cuantos bacilos tenemos en 50 campos, capturándolos en los resultados en tabla.

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