Practica De Inhidrina

INTRODUCCIÓN

Los aminoácidos, péptidos y proteínas son componentes importantes de los alimentos. Por un lado proporcionan los elementos necesarios para la síntesis proteica. Por otro lado, los aminoácidos y péptidos contribuyen directamente al sabor de los alimentos y son precursores de los componentes aromáticos y las sustancias coloreadas que se forman mediante las reacciones térmicas y/o enzimáticas que ocurren durante la obtención, preparación y almacenamiento de los mismos. Los aminoácidos son ácidos carboxílicos que contienen un grupo amino. Existen unos cien en la naturaleza. En el hidrolizado total de las proteínas existen veinte aminoácidos que tienen, con algunas excepciones, la fórmula general siguiente:

R-CH-COOH =NH2

En el caso más sencillo, el radical R es un átomo de Hidrógeno (ácido aminoacético o glicina),en los demás aminoácidos R es un resto alifático, aromático o heterocíclico, que puede ser portador de otros grupos funcionales. Existen diez aminoácidos, denominados aminoácidos esenciales, que el organismo es incapaz de sintetizar y que deben ser aportados por la alimentación, el organismo no los puede sintetizar porque carece del mecanismo necesario para elaborar los cetoácidos correspondientes; se ha comprobado que si se le suministran éstos y sales de amonio es capaz de elaborarlos. Los aminoácidos constituyentes de las proteínas son, aproximadamente, veinte: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina. Todos ellos son aminoácidos excepto dos, que son prolina y la hidroxiprolina, que también pueden considerarse como aminoácidos por su similitud estructural. Se les llama aminoácidos porque el grupo amino está unido al carbono de la cadena que es, por convenio, el átomo de carbono adyacente al grupo carboxilo. Los aminoácidos contienen tantos grupos ácidos como básicos, por lo que tienen propiedades ácidas y básicas débiles y se les llama anfolitos, se comportan como anfipróticos porque pueden aceptar o donar electrones. Las moléculas de aminoácidos transportan una carga negativa y otra positiva, lo que da como resultado una carga total nula, esta forma se conoce como "zwitterion" del aminoácido. La carga total transportada por un aminoácido depende del pH de la solución y de los valores de la constante de acidez de los grupos ionizables presentes. Si el pH es mucho mayor que el valor de la constante de un grupo, se libera un protón y la molécula tendrá una carga negativa, pero si el pH es menor, tendrá carga positiva. El hecho de que a diferentes valores de pH el aminoácido tenga distintas formas y lleve distintas cargas netas se utiliza en muchos métodos analíticos, como en la electroforesis y en la cromatografía de intercambio iónico. El punto iso-iónico de una molécula es el pH en el que el número de cargas negativas debidas a los protones perdidos es igual al número de cargas positivas debidas a los protones ganados, entonces predomina la forma zwitteriónica. El punto isoeléctrico es el pH en el que las moléculas no presentan migración en un campo eléctrico y puede determinarse experimentalmente por electroforesis; en los aminoácidos es igual que el punto iso-iónico. (Lehniger, 1995).

Métodos de análisis de aminoácidos : A menudo es necesario identificar y cuantificar los aminoácidos individuales de una mezcla, tanto en estudios metabólicos como en las investigaciones de la estructura de las proteínas.

Hay diferentes métodos para determinar cuantitativamente a los aminoácidos como lo son, las cromatografías, electroforesis y otros métodos en el que participan tanto las cromatografías como reacciones con dinitrofluorobenceno y fenilisotiocianato. (Mathews, 2002 ).

Uno de estos es la cromatografía en capa fina o de la electroforesis son adecuados para averiguar el número y la cantidad relativa de los diferentes aminoácidos presentes en una muestra (análisis cualitativo), aunque para los análisis cuantitativos es necesaria la cromatografía de gases o un analizador de aminoácidos.

Otra técnica es cromatografía en papel ,esta técnica se basa en el principio de que un compuesto se reparte o distribuye entre dos fases líquidas. En un ambiente que contiene vapor de agua, el papel de cromatografía absorbe una cantidad de agua que mantiene entre las fibras de la celulosa del papel, esta agua se considera como uno de los disolventes y constituye la fase estacionaria. Si se permite que un disolvente no acuoso (la fase móvil) se traslade por el papel impulsada por la acción capilar, tan pronto como el disolvente alcance a cualquier molécula de soluto en el papel, están se distribuirán entre las dos fases en una proporción característica de sus coeficientes de reparto. Cuanto más soluble sea un soluto en la fase móvil, tanto más se trasladara el compuesto por el papel en la dirección del flujo del disolvente y viceversa . Los aminoácidos aparecen como manchas coloridas después de revelar el cromatograma rociándolo con reactivo de ninhidrina. Se desconoce con certeza el mecanismo de la cromotagrafía en papel. Es probable que los constituyentes de la muestra sean retenidos por el papel a causa de su solubilidad en el agua que el papel absorbe, o por absorción de los propios constituyentes de la muestra o por una combinación de ambos (Voet et al., 2012).

La ninhidrina es un poderoso agente y reactivo común para visualizar las bandas de separación de aminoácidos por cromatografía o electroforesis, también es utilizada con fines cuantitativos para la determinación de aminoácidos. Reacciona con todos los aminoácidos alfa cuyo pH se encuantra entre 4 y 8, dando una coloración que varía de azul a violeta intenso. Este producto colorido (llamado púrpura de Ruhemann) se estabiliza por resonancia, la coloración producida por la ninhidrina es independiente de la coloración original del aminoácido. La reacción con la ninhidrina produce colores que sirven como base para la cuantificación de todos los aminoácidos primarios se evalúa midiendo la absorción de la luz con la longitud de onda de 540 nm. Aminoácidos secundarios como la prolina forman productos ligeramente distintos; estos son amarillos tienen su máxima absorción a 440 nm

(Ocampo et.al, 2008).

Objetivos

- Cuantificar el contenido de aminoácidos libres de una muestra problema por el método de ninhidrina.

- Analizar las características fisicoquímicas de los aminoácidos y los fundamentos químicos en los que se basa la cuantificación de aminoácidos por el método de ninhidrina.

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