Practica No. 3 Diseño de oligonucleótidos

Practica No. 3 Diseño de oligonucleótidos

Objetivos

Aprender a diseñar oligonucleótidos con herramientas de bioinformática.

Introducción

Los oligonucleótidos iniciadores o primers son fragmentos complementarios que se van a unir a cada una de las dos cadenas separadas del templado de ADN durante la reacción de cadena polimerasa (PCR) y son aspectos muy importantes de la PCR.

Los primers deben ser elegidos de modo que tengan una secuencia única dentro del DNA que será amplificado. Un primer diseñado con una secuencia altamente repetida dará lugar a productos no deseados, es decir, pueden amplificar otros fragmentos de ADN distintos a los buscados (amplificación inespecífica). Sin embargo, el mismo primer puede dar una sola banda si se amplifica una sola clona de una biblioteca genómica.

Existen reglas para diseño de los mismos, algunas se han demostrado como útiles como: cada primer individual debe contar con una longitud de 18-24 bases, debe mantener un contenido de guanina y citosina entre 40 y 60 %, los dos primers del par deben de tener temperatura de fusión “tm” cercanos (dentro de los 5 °C), la secuencia de los primers individuales debe iniciarse y terminarse con 1 o 2 bases púricas y debe evitarse regiones con potencialidad para formar estructuras secundarias internas. (Giorgio, 2017)

Discusión

A partir de 3 secuencias distintas de bacterias con el gel ADN 16S ribosomal se extrajeron secuencias de oligonucleótidos, utilizando para ello la página de Primer-BLAST: NCBI. Para aumentar la probabilidad de encontrar oligonucleótidos funcionales se seleccionaron 3 pares de los mismos por cada bacteria.

Las propiedades de los oligonucleótidos fueron calculadas con OligoCal (Biotools Nubic Northwestern) y se aceptaron como funcionales aquellos que no formaban estructuras secundarias, como orquillas.

Al diseñar los oligonucleótidos para Amblyomma sp. ADN A375 16S ribosomal RNA gene (Tabla 1) se obtuvo que el Primer par 4 es el mejor para llevar a cabo la amplificación porque no forman orquillas, tienen un porcentaje de GC similar (36.0% - 40.91%) y el par de oligonucleótidos no son complementarios; mientras que los Primer´s par 3 y 5 forman orquillas, tienen un porcentaje de GC muy similar, pero los oligonucleótidos son complementarios.

Para la secuencia de Helicobacter cinaedi strain ADN 0413 16S ribosomal RNA gene (Tabla 2) el Primer par 2 es útil debido a que su porcentaje GC es de 55% en ambos oligonucleótidos, no forman orquillas y no son complementarios. En comparación con los Primer´s par 1 y 5, estos pares tiene un porcentaje de GC entre 60-55%, son complemetarios y forman orquillas.

En la tercera secuencia Amblyomma sp. ADN A380 16S ribosomal RNA gene (Tabla 3) obtuvo como mejor elección el Primer par 4 por el porcentaje de GC (40.0% - 40.91%) además de que no forman orquillas y no son complementarios. Y las Primer´s par 2 y 3 tienen un porcentaje de GC muy similar, pero son pares de oligonucleótidos complementarios y forman orquillas.

Para el diseño de cebadores se deben cumplir al menos tres condiciones en cada par de oligonucleótidos. Dichas condiciones son que cada pareja de cebadores debe tener temperaturas de alineamiento muy cercanas para maximizar el rendimiento, lo cual suele traducirse en un contenido en GC similar, entre 50% y 60%; los primers no deben favorecer formación de estructuras secundarias como las horquillas, ni deben ser complementarios. (Dieffenbach, 2003)

...