Prevención de enfermedades de proteostasis por inhibición selectiva de subunidad reguladora de fosfatasa

Paper 7: Prevención de enfermedades de proteostasis por inhibición selectiva de subunidad reguladora de fosfatasa

- Una primera línea de defensa contra la acumulación de proteínas mal plegadas en el RE consiste en la fosforilación de la subunidad a del factor de iniciación de traducción 2 (eIF2a) en Ser 51 para disminuir la síntesis de proteínas, una respuesta adaptativa al estrés esencial para la supervivencia.

- Guanabenz (GBZ) puede prolongar esta respuesta adaptativa por la unión selectiva y la inhibición de la subunidad reguladora de la fosfatasa de Eif2a inducida por estrés compuesta por PPP1R15A y PP1c. GBZ ahorra PPP1R115A-PP1c fosfatasa de eIF2a constitutiva, evitando la permanente fosforilación de eIF2a, lo cual podría ser letal.

- GBZ incrementa la disponibilidad de chaperonas a proteínas mal plegadas y consecuentemente rescata células del colapso proteostático. Corrigiendo estos defectos de la proteostasis, podrían en teoría beneficiar una amplia gamma de enfermedades caracterizadas por la acumulación de proteínas mal plegadas.

- Sin embargo, la identificación de un enfoque terapéutico valioso representa dos desafíos: alcanzar eficacia pero sin efectos adversos. In vivo, GBZ no puede ser utilizado selectivamente para inhibir PPP1R15A porque esta es una droga hipotensiva activa centralmente con afinidades nM para el receptor adrenérgico a2.

Fig.1

A) -Buscando inhibidores de PPP1R115A desprovisto de actividad adrenérgica a2, se sintetizaron derivados de GBZ, uno de los cuales se identificó como Sephin1 (inhibidor selectivo de holofosfatasa).

B) -Se evalúa si Sephin 1 se une a fragmentos recombinantes de la subunidad de la fosfatasa. Se realiza una electroforesis tiñendo con Coomasie. Se marca selectivamente Sephin-1 con biotina y se corre en un gel con los los fragmentos en perlas de neutravidina. La neutravidina unen fuertemente a la biotina señalando si hay unión.

-Sephin 1 se une específicamente a un fragmento recombinante de PPP1R15A (aa 325-636) pero no al altamente relacionado PPP1R15B (aa 340-698).

C) -Se realizaron inmunoprecipitaciones de los complejos R15A y R15B de células. Estas son tratados con vehículo, 50 Um de GBZ o Sephi-1 por 6 horas, y luego se analiza por Western blot.

-Sephin-1 separó el complejo R15A y se conservó complejo R16B. Lo cual es importante ya que se ha demostrado que la falta de ambos es letal.

En otro estudio se confirmó la selectividad de Sephin1, al demostrar que este no inhibe la subunidad PP1c.

D) -Se realizó un Western Blot con proteínas de interés en lisados de células HeLa tratadas con Tunicamicina, que es un antibiótico que induce el estrés del RE, en presencia y en ausencia de Sephin1 por el tiempo indicado, usando tubulina como control.

Eif2a es una proteína sensora del estrés de RE. Al fosforilarse aumenta la traducción de ATF4, que es un factor de transcripción que a la vez induce la expresión de genes relacionados a la privación de aa, a la resistencia al estrés oxidativo, a la expresión de chaperonas como BIP y a la expresión de CHOP que es otro factor de transcripción que induce la apoptosis.

- Se observa un prolongamiento de la fosforilación de Eif2a y un consecuente retraso en la expresión de BIP, en la expresión de ATF4 y de CHOP.

E) Se determina la magnitud de proteínas recién sintetizadas a través del tiempo, que son marcadas radiactivamente con S35 en residuos de metionina, en célula HeLa tratadas con Tunicamicina con o sin GBZ y Sephi-1, lo cual fue revelado con autoradiografía, haciendo previamente una electroforesis. Abajo se muestra teñido con Coomasie.

Se observa un retraso en la recuperación de la traducción, lo que explicaría la menor expresión de genes del estrés.

En otra figura, Sephin1 no afecta la fosforilación de Eif2a en ausencia de estrés, lo se espera ya que R15A sólo se expresa bajo estrés.

F) Se analizó la viabilidad de las células con el gen de PPP15RA (expresado en fold change), y se comparó con el wyld-type al administrar dosis crecientes de Sephin1.

La selectiva inhibición de R15A por Sephin1 protegió células del estrés citotóxico del ER de forma dosis dependiente, pero esto fue abolido en células carentes del alelo funcional de PPP1R15A. La actividad citoprotectiva de Sephin1 se debe a la inhibición selectiva de PPP1R15A.

G) Se determinó si la Sephin1 tenía actividad adrenérgica a2, como si la tiene GBZ, en células recombinantes humanas que expresan el receptor a2A.

Sephin 1 carece de actividad como agonista de a2A, en contraste de GBZ, confirmando que es selectivo de PPP1R15A.

Fig. 2

En otra figura, se observa que dosis Sephin1 de 1 o 10 mg/kg administrados oralmente desaparecieron rápidamente del plasma pero se concentraron en el sistema nervioso alcanzando concentraciones de 7 a 44 veces mayores en el cerebro y nervio ciático que en el plasma, tal como GBZ. GBZ en humanos causó somnolencia y coma.

A) Se analiza el rendimiento motor de ratones mediante un test con rotarod, donde se ponen en una barra rotatoria y se ve su capacidad de coordinación motora para lograr no caerse.

Se puede ver que los ratones a los que se les administró GBZ manifestaron efectos laterales dosis dependiente al disminuir su rendimiento (se demoraban menos en caer). Con Sephin1 no se vio empeorado el rendimiento.

B) Se determina la ganancia de peso de los ratones con un tratamiento crónico de Sephin1 (1mg/kg oral). No se observa un aumento de peso significativo.

C)D)E) Se valuó si Sephin1 tenía efectos adversos en la memoria debido a la manipulación de la fosforilación de eiF2a o PP1c. Para ello se utiliza el laberinto de agua de Morris, que es una piscina circular con agua que contiene una plataforma que debe ser localizada por el animal. Los ratones estuvieron entrenando por 5 días consecutivos y se determinó el tiempo de latencia, la distancia y el tiempo de ocupancia de cuadrantes después de ser removida la plataforma.

Ratones mostraron un aprendizaje espacial normal y mejoraron su capacidad (latencia y distancia) de encontrar una plataforma sumergida con el entrenamiento y recordaron donde estaba la plataforma después de ser removida.

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