Propósito de la extracción de ADN
Enviado por AndreitaM23 • 6 de Mayo de 2017 • Resumen • 1.419 Palabras (6 Páginas) • 278 Visitas
Propósito de la extracción de ADN
En muestras biológicas de escenas de crimen se analizan otras sustancias además de ADN; las proteínas que protegen el ambiente del ADN pueden inhibir la habilidad para analizar éste, por lo que se recurre a metods de etxraccion.
Los metods de extracción permite remover los inhibidores de la PCR, con estois métodos se obtiene alto contenido de ADN; el objetivo principal de la extracción se basa en 3 puntos: 1) lisar las células, 2)separar la moilecula de ADN de otro material etxracelular y 3) Aislar el ADN en un formato compatible y puro para aplicaciones siguientes como la amplificación de la PCR.
La cantidad y calidad del ADN debe ser medida para el procesamiento con procedimientos analíticos que aseguren optimos resultados.
Se debe extremar cuidados en las muestras de ADN para evitar contaminación de muestra con muestra o inserción de ADN extracelular., el porceso de extracción es el que es mas suceptuble a la contaminación.
Un metodo común de extracción es mediante muetsras de sangre, se recoge 1 gota de sangre en 1 algodón, 1 gota posee aprox 70000-80000 globulos blancos y una concentración de 500ng de material génico.
El ADN es extraido a una tempratura aprox de -20 a -80 en donde se da un almacentiemto térmico largo, esto con el fin de evitar la actividad catalítica de las nucleasas. Las nucleasasd son enzimas que degradan el ADN para recilcar componentes nucleotidicos, necesitan de Mg para su acción por lo que se usa un inhibidor de ésta como el EDTA compuesto libre de Mg que previen la destrucción del ADN por las nucleasas.
Inhibiodres de PCR y degradación de ADN
En los análisis de muestras bilogicoas forenses el propósito es evitar la degradación del ADN asi como remover los inhibidores de la PCR. La presencia de inhibidores o degradación del ADN dirige a un fracaso en la amplificación de la PCR .
Unos inhibidores comunes de la PCR son la hemoglobina y melanina; estos inhibidores se enlazan al siio activo de la ADN TAQ polimerasa y reducen la adecuada amplificación de la PCR.
El ADN se degrada por una serie de mecanismos enzimáticos y porcesos químicos, una vez muerto el organismo las molecualas de ADN se degradan por las nnucleasas.
El principal objetvio para el clivaje hidrolitico es la base azúcar glicosidica, un rompitmieno ahí dirige a la perdida de nucleobases y se hace un Nick en el sitio sin base de la simple cadena.
El calor o la humedad aceleran el clivaje hidrolitico son enmigos de las moleuclas de ADN intactas, además la radiación UV puede dirigir al entrecruzamiento adyacente de nucleótidos de timina en las moléculas de ADN, las cuales previenen el paso del la polimerasa durante el PCR.
Técnicas para la extracción de DNA
El procedimiento de extracción de DNA varía en función de la naturaleza de la muestra, por ejemplo muestra de sangre, hueso o semen, existen cuatro técnicas:
- extracción orgánica
- extracción con Chelex
- FTA
- Extracción de fase sólida
- Extracción orgánica con fenol cloroformo
Esta técnica ha estado mayor tiempo y más extensamente usada. Trabaja con ADN de alto peso molecular para RFLP(Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción). Esta técnica requiere de:
- Sodio dodecil sulfato SDS
- Proteinasa K para romper la membrana celular y degradar las proteínas que protegen el DNA en sus cromosomas
- Fenol cloroformo se adiciona para separa el DNA de las proteínas
Posterior el DNA se encuentra soluble en la fase acuosa, se centrifuga para separar de las proteínas e impurezas, ahí el DNA puede ser transferido para el análisis
Las desventajas de este método son:
- Requiere químicos peligrosos
- Transferencias múltiples de la muestra (incrementa el error y la contaminación)
- Consume tiempo
- Chelex extraction
Método alternativo usado por ciencia forense, uso de resina -quelante que puede ser aplicada directamente a la muestra (sangre, mancha de sangre, semen), el chelex 100 es una resina de intercambio iónico que se adiciona en forma de suspensión a la muestra, es mas rápida que la extracción orgánica.
Ventajas
- Pocos pasos
- Menor posibilidad de contaminación
Desventajas
- Demasiado volumen de muestra no permite usar en PCR
- FTA paper
Se desarrolló como u método para almacenar DNA, es un papel absorbente de celulosa que contiene 4 sustancias para proteger el DNA de bacterias y de degradación.
El DNA en TFA paper es estable a temperatura ambiente, en un periodo de varios años.
Usos
Se plica la muestra sobre el papel, y se deja secar. Las células son lisadas al entrar en contacto con el papel y el DNA procedente de glóbulos blancos es atrapado en la matriz del papel. Se toma un segmento del papel y se coloca en un vial para su análisis. Se lava con FTA purificación regent para remover grupos hemo e inhibidores de PCR.
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