RESÚMEN: ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS NO DERIVADOS MEDIANTE ESPECTROMETRÍA DE MASAS DE IONIZACIÓN

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RESÚMEN: ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS NO  DERIVADOS MEDIANTE ESPECTROMETRÍA DE MASAS DE IONIZACIÓN POR ELECTROSPRY EN TÁNDEM: UNA NUEVA HERRAMIENTA PARA EL DIAGNÓSTICO DE TRASTORNOS HEREDADOS DEL METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS. ESTUDIO DE LA FRAGMENTACIÓN DE 79 MOLÉCULAS DE INTERÉS BIOLÓGICO  EN  EL  MODO  DE  IONIZACIÓN  POSITIVO     Y NEGATIVO.

El deterioro del metabolismo de aminoácidos (AA) puede provocar un desequilibrio (aumento o disminución) en la concentración de las variantes catabólicas de los 20 L-aminoácidos que estructuran proteínas (VC20Laa); y a consecuencia, la aparición de síntomas clínicos, que generalmente no son específicos para un solo trastorno, debido a que una o varias de éstas moléculas pueden ser biomarcadores de uno o de un grupo de trastornos. Por lo que la detección y cuantificación simultánea de las VC20Laa en fluidos biológicos (principalmente plasma, orina, líquido cefalorraquídeo y líquido amniótico), es requerido para el diagnóstico del deterioro del metabolismo de aminoácidos, y a su vez, para la evaluación de posibles terapias.

La mayoría de los métodos utilizados para el análisis de AA implican una separación cromatográfica siguiente o anterior a la derivatización de AA, con la detección del grupo funcional con absorción de luz UV o fluorescente; sin embargo, aunque estos métodos mejoran la sensibilidad, la etapa de derivatización manual es una fuente de dificultades por lo que los resultados presentan gran variación.

La espectrofotometría de masas en tándem (MS/MS) se ha utilizado en el estudio de errores innatos del metabolismo, incluyendo metabolismo de aminoácidos. Los primeros estudios en el campo de los AA ocupa principalmente la detección neonatal de los trastornos hereditarios del metabolismo de AA en muestras de sangre de recién nacidos mediante el bombardeo atómico rápido, y finalizando con el uso de la ionización por electrospray (ESI). Sin embargo, la cuantificación de AA a partir de una matriz biológica sin derivatización es ventajoso con el fin de reducir los errores introducidos por problemas tales como la inestabilidad de derivación, las reacciones secundarias y las interferencias de reactivos. Desde 1995, la detección de AA sin derivatizar ha sido descrita por ESI-MS, que muestra la posibilidad de ionización positiva y negativa. Desde entonces, se ha logrado el análisis por electroforesis capilar / ESIMS / MS de 20 AA proteinogénicos sin derivatizar y 31 AA fisiológicos en una mezcla estándar. Al mismo tiempo, la cromatografía líquida de fase inversa de pares de iones diferentes metodologías (IP-RPLC) se han desarrollado en el que se ha logrado el análisis de la 20 AA proteinogénicos sin derivatizar en fases ligadas de sílice de octadecilo o material de carbono grafítico porosa utilizando ácidos carboxílicos perfluorados como iones reactivos y la detección ESI-MS / MS.

Un método similar fue utilizado para la separación y cuantificación de siete AA en medios de fermentación y 22 AA en muestras de plasma. Estos informes plantean la posibilidad de analizar AA en los fluidos biológicos para el diagnóstico de trastornos hereditarios del metabolismo de AA por LC / ESI-MS / MS. Se espera una alta sensibilidad de detección, lo que permite la determinación de AA en el volumen de muestra limitada, sobre todo en pediatría. Sin embargo, el inconveniente de la tecnología de MS / MS es que todas las moléculas que se buscaron tienen que ser predefinidas, con el fin de no perder omitir una enfermedad.  

El objetivo de este proyecto es estudiar la viabilidad de sustituir el método de análisis por cromatografía de intercambio iónico real AA por otro, usando LC / ESI-MS / MS. Esto incluye el estudio preliminar de la fragmentación de todas las moléculas de interés biológico en el modo de ionización positiva y negativa, y será seguido por el estudio de su separación cromatográfica, su cuantificación, y, por último, la validación del método.

En este informe, se presenta la investigación de la fragmentación de 79 moléculas de interés biológico en el modo de ionización positivo y negativo, además de 37 moléculas fisiológicas o terapéuticas, presentando ya sea un interés biológico para algunos diagnósticos, o un riesgo potencial de interferencias con analitos. Se optimizaron los parámetros de MS / MS para obtener la mejor especificidad y sensibilidad para su detección, utilizando isótopos marcados estándar obtenidos de Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA, USA), como una mezcla set A (ref NSK-A): 15N,13C-Gly (Gly*), 2H4-Ala (Ala*), 2H8-Val (Val*), 2H3-Leu (Leu*), 2H3-Met (Met*), 2H3-Phe (Phe*), 13C6-Tyr (Tyr*), 2H3-Asp (Asp*), 2H3-Glu (Glu*), 2H2-Orn (Orn*), 2H2-Cit (Cit*), y 2H4,13C-Arg (Arg*).

La espectrometría de masas se llevó a cabo en un API 2000 ESI-MS/MS de sistema triple cuadrupolo, que incluye una bomba de jeringa y un TurboIonSpray (metodología completa en el trabajo de (Piraud et al., 2003)).

Resultados y Discusión

De las 79 moléculas evaluadas solo 41 fueron capaces de dar un ión [M-H]- y fragmentos negativos.

Muchos AA de interés para el diagnóstico de los trastornos hereditarios más frecuentes del metabolismo de AA no se detectaron (particularmente Leu, (a) Ile, Val, Arg, Orn, Lys, Tyr). Entre los compuestos detectables, sólo se encontró una situación isobárica; las dos moléculas implicadas (Nacorn y figlu) presentaron una transición específica (173> 131 y 173> 128, respectivamente). Por otro lado, 12/79 moléculas no mostraron ningún ion [M+H]+ en condiciones neutras; sin embargo, en condiciones ácidas, 9/12 de éstas moléculas fueron capaces de aumentar la intensidad de ionización positiva, lo que mejora su detección y define sus espectros MS/MS.

Finalmente 3/12 moléculas (Orot, orotidina y la PEA) no se pudieron detectar en el modo de ion positivo, incluso en condiciones ácidas, fueron detectadas eficientemente en el modo negativo; principalmente debido a que éstas moléculas presentan residuos altamente ácidos en su estructura.

Por otro lado, 38 moléculas podrían ser detectados en los dos modos. La mayoría de ellos fueron detectados de mejor manera en modo positivo. Algunos de ellos fueron detectados mejor en el modo negativo (como Tau, S-Cys, Cit, Gla...). Sulfurcontaining AA (Cys, Hcy) mostró una ligera señal en los dos modos, pero estaban mejor detectado como su forma oxidada ((Cys) 2, (Hcy) 2). Treinta y ocho otras moléculas no pudieron ser detectados en el modo negativo. Todos ellos muestran una buena señal en modo positivo, a excepción de Gly, una pequeña molécula difícil analizar con dicha técnica.

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