RESULTADOS Y DISCUSIÓN PRODUCCIÓN DE LA ENZIMA

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

PRODUCCIÓN DE LA ENZIMA

La cinética de producción de a-amilasa en los diferentes medios de cultivo se presenta en la figura que representa la Actividad a-amilasa durante cultivos en FFS (-) y FLS (—) usando almidón de yuca (O) y yuca rallada () como sustrato. Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones.[pic 1]

En los medios con yuca rallada en dos días hay un incremento de la actividad a-amilasa a que fue de 8,21 U/mL para la FFS y 6,15 U/mL para la FLS. En cuanto a los medios con almidón de yuca, la actividad enzimática no presento incremento hasta después de 5 días que apareció un incremento en la actividad enzimática en la fermentación líquida sumergida que presenta un valor máximo de 7,76 U/mL a los 10 días de observación.

El crecimiento de P. commune, un hongo filamentoso, se favoreció en el medio sólido empleando yuca rallada; este medio ofrecía una mayor área superficial y presentaba una textura más rugosa, semejante a las condiciones de los hábitats usuales de este microorganismo.

Los resultados obtenidos sugieren que la yuca rallada constituye un mejor soporte para la producción de a-amilasa por P. commune y que, en caso de usar almidón de yuca en fermentación en fase sólida, la producción de la misma cantidad de a-amilasa tomaría más tiempo.

PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA

El extracto crudo fue precipitado por adición de sulfato de amonio, la mayor actividad a-amilasa se encontró en la fracción 50-80%, esta fracción fue aplicada a una columna de DEAE Sephadex A-50, cuyo perfil de elusión (Figura 2) mostró un único pico con actividad a-amilasa luego de la adición de buffer fosfato 50 mM, pH 6,0 NaCl 0,2 M. Las fracciones del pico con actividad fueron reunidas en el pool DEAE-pico II, el cual fue dializado contra agua destilada y liofilizado, alcanzando un grado de purificación de 10,53.

Este pool fue aplicado a una columna de Sephadex G-75, la elusión se realizó con NaCl al 1%. El perfil cromatográfico (Figura 3) mostró un único pico de actividad a-amilasa, las fracciones del pico activo fueron reunidas en el pool G-75 pico II, el cual fue dializado contra agua destilada y liofilizado, con este paso se alcanzó un grado de purificación de 28,75.

El pool G-75 pico II se disolvió en buffer fosfato 50 mM, pH 7,0, y fue aplicado a una columna de CM Sephadex C-50. El perfil de elusión (Figura 4) mostró un único pico con actividad -amilasa luego de la adición de buffer fosfato 50 mM, pH 7,0 NaCl 0,1M. Las fracciones con actividad fueron reunidas en el pool CM- pico I, el cual fue dializado contra agua destilada, liofilizado y disuelto en buffer fosfato 50 mM, pH 7,0, alcanzando un grado de purificación final de 61,85. Este pool mostró una sola banda en la electroforesis SDS-PAGE (Figura 5), indicando la purificación hasta la homogeneidad de la enzima.

PESO MOLECULAR

La comparación de la movilidad electroforética de la -amilasa de P. commune con la de los marcadores de peso molecular en una electroforesis SDS-PAGE (Figura 6) permite establecer un peso molecular de 35 kDa. El rango de peso molecular para las -amilasas oscila entre 10 y 210 kDa (2), sin embargo, la mayoría de las -amilasas microbianas tienen su peso molecular entre 30 – 70 kDa, rango en el que se encuentra la -amilasa de P. commune.

EFECTO DE PH SOBRE LA ACTIVIDAD Y LA ESTABILIDAD DE LA ENZIMA

Cuando la actividad de la enzima fue ensayada con diferentes valores de pH, la máxima actividad se obtuvo con pH 6,0. En otros estudios, el pH óptimo de la -amilasa de Penicillium chrysogenum fue de 5,0 (7) y el de la -amilasa de Penicilium griseofulvum de 5,5 (8). Aunque el pH óptimo para las -amilasas varía entre 2,0 y 12,0 (2), la mayoría de las -amilasas microbianas tienen su pH óptimo en el rango ligeramente ácido a neutro, rango en el que se encuentra el pH óptimo de la a-amilasa de Penicillium commune.

Luego de la incubación de la enzima por 1 h en buffer de diferente pH, se observa que la enzima fue estable en el rango de pH 5,0-7,0. La enzima retuvo 95% de su actividad con un pH 5,0 y 98,8% con un pH 7,0. Rangos de estabilidad en el pH similares han sido reportados para las a-amilasas de Aspergillus awamori

(16) y Thricoderma viride (17).

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD Y LA ESTABILIDAD DE LA ENZIMA

La temperatura a la cual se alcanza la máxima actividad y, por tanto, corresponde a la temperatura óptima de reacción, es 70 °C. Cuando se sobrepasa este valor, la actividad disminuye rápidamente porque la enzima se va desnaturalizando. Como se puede observar en la Figura 7, cuando la enzima fue incubada durante una hora en buffer fosfato 100 mM, pH 6,0 en un rango de temperatura entre 40 y 92 ºC, la actividad decreció rápidamente a partir de 50 °C, indicando que el rango de estabilidad térmica de la enzima es 0-50 °C. Vale la pena destacar que la enzima conserva 35% de su actividad después de ser calentada una hora a 92 ºC. Una consecuencia de orden práctico-derivada de este hallazgo, es la necesidad de revisar cuál es el tiempo requerido para la inactivación total de la enzima en las medidas de actividad por el método de Nelson- Somogyi.

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