Separación De Aminoácidos Y Proteínas

Métodos de separación para aminoácidos y proteínas

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Técnica de separación que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento al ser arrastrados por una fase móvil (líquida) a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria (líquida); en donde ambas fases se encuentran en equilibrio.

La separación en este tipo de cromatografía se basa en la polaridad que tengan los aminoácidos y proteínas a separar con las dos fases con las que se trabaja. En la actualidad lo más común es que se trabaje en fase reversa, en donde la fase estacionaria es apolar mientras que la fase móvil es polar.

Se utilizan resinas de diámetro fino fuertemente empaquetadas para superar las limitaciones del flujo al bombear las soluciones de proteínas y aminoácidos a través de la columna bajo alta presión. En el caso de usar proteínas apolares estas quedaran retenidas por un mayor tiempo debido a la fase estacionaria; al contrario si se usan proteínas polares estas serán las primeras que saldrán de la elución en la cromatografía debido a la poca afinidad que tendrán con la fase estacionaria.

También existe una técnica adicional de separación utilizada con HPLC, el uso de resinas hidrofóbicas para retardar el movimiento de proteínas no polares. Las proteínas entonces se lavan de la columna con un gradiente de concentración creciente de un solvente orgánico.

Electroforesis

Electroforesis en gel

Técnica de separación de las proteínas caracterizada según tamaño y carga por la separación en una corriente eléctrica dentro de geles sólidos hechos de acrilamida. El gel es una lámina fina de acrilamida polimerizada entre dos placas de cristal. Esta técnica utiliza un detergente negativamente cargado (sulfato dodecil de sodio) para desnaturalizar y solubilizar las proteínas.

Las proteínas desnaturalizadas por el SDS tienen una carga negativa uniforme de tal manera que todas las proteínas migran a través del gel en el campo eléctrico basado solamente en su tamaño. Mientras más grande es la proteína se moverá más lentamente a través de la matriz del poliacrilamida. Luego de la electroforesis se analiza la distancia de migración de las proteínas desconocidas comparándolas con estándares.

Otro variante de la electroforesis que se puede utilizar es la electroforesis capilar, en la que se utiliza una varilla de vidrio recubierta con poliamida que está conectado a dos soluciones tampón una con un electrodo cargado negativamente (cátodo) y uno con carga positiva (ánodo).

En este tipo de electroforesis cuando se aplica el voltaje hace que el flujo de cationes en exceso que arrastra el tampón para el cátodo, actúa como una bomba que causa el movimiento del tampón y de la muestra

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