TINCIONES SIMPLES Y COMPUESTAS

TINCIONES DIFERENCIAL Y ESTRUCTURAL

Collazos Kattleen 1113684201; Aperador Felipe 1098789594; Bastidas Mariana 069601123; Morales Walter 1090495434

Departamento de Ciencias Básicas; Microbiología.

15 de Mayo del 2015

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RESUMEN: Las tinciones bacterianas son de gran importancia en la microbiología, debido a que permiten conocer las propiedades y características de las bacterias. Esta práctica tiene como objetivo conocer los diferentes tipos de tinciones, simples y compuestas realizadas en los laboratorios de microbiología. Los colorantes que se usan para realizar una tinción, se pueden clasificar de dos maneras: naturales y sintéticos. Se utilizó las técnicas de tinción de capsulas como la coloración GRAM, método de HISS, tinción de NIGROSINA, tinción de ESPORAS.  

Palabras claves: tinción, colorantes, esporas, técnica.

INTRODUCCION: El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. (1)

• Tinción GRAM: también conocida como coloración de Gram, es una técnica de laboratorio que se utiliza rutinariamente en los estudios microbiológicos de las bacterias. Fue diseñada por Christian Gram, un científico danés, en el año 1884. El objetivo de Gram era conseguir una prueba con la que fuera posible diferenciar diferentes grupos de bacterias para así poder estudiarlas y clasificarlas. Los colorantes tiñen la pared de las bacterias de color morado y, tras unos minutos, se realiza un lavado del colorante. Después de eso puede que el colorante permanezca en la pared bacteriana o que se haya ido. En el primer caso permanecería el color morado, y se trataría de bacterias Gram positivas y, en el segundo, la pared tendría un color rosado, y serían Gram negativas. (2)

La cápsula bacteriana es la capa con borde definido forma da por una serie de polímeros orgánicos que en las bacterias se deposita en el exterior de su pared celular. Generalmente contiene glicoproteínas y un gran número de polisacáridos diferentes, incluyendo polialcoholes y aminoazúcares.

La cápsula es una capa rígida organizada en matriz impermeable que excluye colorantes como la tinta china. En cambio, la capa de material extracelular que se deforma con facilidad, es incapaz de excluir partículas y no tiene un límite definido, se denomina capa mucosa o glucocalix. Ambas se pueden detectar con métodos como la tinción negativa o la tinción de Burri. (3)

• Método de hiss: se emplea para la coloración de capsula en las bacterias, ya que por métodos simples o GRAM no se tiñen. Las células se ven teñidas intensamente y la capsula de azul o rosada según se use violeta o fucsina.

• Tinción de nigrosina: Este método de tinción utiliza colorantes neutros o ácidos ya que tienen poca afinidad por la célula bacteriana por lo tanto como no se absorben se colorea el fondo en el que están las bacterias pero la célula queda incolora y transparente, así pues las bacterias aparecen como pequeñas áreas iluminadas en un fondo oscuro. La tinción acídica con nigrosina, o neutral  (con tinta china) son las más usadas. (4)

• Tinción de esporas: las esporas están formadas por una cubierta alrededor del ADN y una pequeña porción del citoplasma dentro de ella; esta estructura posee una mayor resistencia los agentes físico y químicos que la célula vegetativa.

Tinción diferencial: Las bacterias se diferencian unas de otras tanto física como químicamente, por lo cual su reacción ante algunos colorantes también será diferente dando lugar así a grupos tintoreales característicos. Entre estos grupos están los que se originan por la tinción descubierta por Hans Christian Gram, esta tinción divide a las bacterias en Gram positivas o Gram negativas lo cual no solo sirve para diferenciarlas sino aún para elegir la terapia adecuada en algunos casos. Existen otras tinciones diferenciales de utilidad en microbiología clínica como la de Ziehl- Neelsen.

Tinción estructural: Existen diferentes tipos de colorantes que de acuerdo a su afinidad se utilizan para teñir y detectar ciertas estructuras de la célula bacteriana como son las esporas, los flagelos y las cápsulas. (4.1)

MATERIALES Y MÉTODOS:

Para realizar correctamente los procedimientos de la investigación, todos los integrantes del grupo estuvieron presentes además, se necesitó de la indumentaria respetiva, así como también de algunos utensilios:

• 5 portaobjetos
• 1 cubreobjeto
• 1 mechero
• Agua destilada
• Safranina
• Cristal violeta
• Nigrosina
• Verde de malaquita
• Sulfato de cobre
• Alcohol acetona
• Fucsina
• Lugol
• Klebsiella spp
• Bacillus cereus
• Salmonella spp
• Staphylococcus spp

PROCEDIMIENTO:

1. Para realizar el método de hiss se debe tener en cuenta la técnica adecuada:

1. realizar un frotis a partir de Klebsiella spp fijándolo al calor
2. cubrir el frotis con cristal violeta, llevándolo al calentamiento sobre el mechero por 1 minuto
3. escurrir el exceso del colorante, lavar con solución de sulfato de cobre (CuSO4)
4. escurrir y dejar secar a T° ambiente y llevar a observación hasta 100x

1. Para realizar la técnica de nigrosina se debe tener en cuenta:

1. realizar un frotis a partir de Klebsiella spp, no se debe fijar al calor
2. colorear con safranina durante 2 minutos, lavar con abundante agua destila
3. colocar 1 gota de tinta china o nigrosina en un extremo del portaobjeto
4. arrastrar con un cubreobjeto por todo el frotis
5. dejar secar a T° ambiente y llevar a observación hasta 100x

1. Para la tinción de espora se realiza de la siguiente manera:

1. realizar un frotis a partir de Bacillus cereus, fijarlo y dejar secar
2. colorear con verde de malaquita, llevarlo al calor durante 3 a 5 minutos sobre el mechero
3. pasados los 5 minutos dejar enfriar el portaobjeto, lavar con agua destilada
4. colorear con safranina durante 1 a 2 minutos, lavar, dejar secar y observar hasta 100x

1. La técnica adecuada para realizar una tinción de GRAM es:

1. realizar 2 frotis a partir de Staphylococcus spp y Salmonella spp
2. agregar el colorante cristal violeta durante 1 minuto, lavar con agua destilada
3. aplicar lugol durante 1  minuto y lavar
4. agregar alcohol acetona durante 30 segundo y lavar
5. aplicar safranina o fucsina durante 30 segundos, lavar y dejar secar a T° ambiente
6. llevar a observación hasta 100x

RESULTADOS:

1. se logra observar la Klebsiella spp en forma de Bacilos Gram-positivos, ya que el cristal violeta tiñe la pared celular de la célula, la capsula de la bacteria torna lumínica (brillante).

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Imagen 1. Klebsiella spp, Gram-positiva.

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