TP Nº 1: MEDIOS DE CULTIVO

TP Nº 1: MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo para células, tejidos u órganos aportan las sustancias esenciales para el crecimiento y controlan, en gran parte el patrón de desenvolvimiento in vitro.

El metabolismo general de la planta que crece en condiciones de in vivo se reproduce en el cultivo in vitro, aunque las condiciones especiales requieren, en muchos casos el suplemento de nutrientes, sobre todo como complemento de sustancias biosintetizadas por las células que deben ser adicionadas en forma de compuestos orgánicos para las necesidades metabólicas, energéticas y estructurales inmediatas.

Estos medios están sustentados en el uso de macronutrientes, micronutrientes, suplementos orgánicos (vitaminas, carbohidratos) y reguladores de crecimiento. La elección de las sustancias y las combinaciones entre ellos fueron probados desde los comienzos del desarrollo de las técnicas de cultivo in vitro, dando como resultado las soluciones de Knop, Gautheret, De Fossard, White, Gamborg (B5) y Murashige & Skoog (MS), entre otras. Las tres últimas son las más utilizadas en la actualidad, aunque pueden modificarse para los casos de materiales que así lo requieran.

Componentes de los Medios Nutritivos:

        El estudio de los medios nutritivos se orienta a obtener formulaciones de composición conocida y controlada, de modo de lograr resultados reproducibles en cualquier época y lugar. Para su preparación se usarán drogas libres de impurezas minerales, de calidad analítica (drogas proanálisis).

• Agua

Es el componente que se encuentra en mayor cantidad en el medio y es una fuente potencial de impurezas que puede afectar el crecimiento de los cultivos.

El agua utilizada en la preparación de medios de cultivo debe ser destilada y desionizada, o bidestilada. Esto se logra mediante el uso de destiladores, filtros de carbón activado o acetato de celulosa y columnas de intercambio iónico. Se debe almacenar en envases de material que no aporten impurezas orgánicas o inorgánicas. (vidrio o PVC)

• Macronutrientes

Los macronutrientes son elementos esenciales que la planta los requiere en cantidades del orden de gramos/litro (C, H, N, O, S, Mg, Ca, K, P). Son incluidos en los medios de cultivo en forma de sales inorgánicas, pudiendo el nitrógeno y el azufre ser incorporados como suplemento orgánico (P.ej. caseína hidrolizada, urea, aminoácidos).

El comportamiento de los elementos esenciales en el cultivo in vitro difiere en ocasiones, de lo observado in vivo, debido principalmente a las condiciones propias del crecimiento en un ambiente confinado.

• Micronutrientes

Los micronutrientes son elementos esenciales que la planta requiere en cantidades del orden de mg/litro (Fe, Mo, Ni, Cu, Zn, Mn, B). Los micronutrientes del medio de Murashige & Skoog incluyen todos aquellos elementos minerales aceptados como esenciales para plantas superiores, con el agregado de Co y I. El agregado de Na+ o Cl- se verifica para algunos medios en particular, como acompañantes de otros iones.

• Carbohidratos

Las células, tejidos y plántulas cultivadas in vitro no poseen las condiciones de irradiancia ni la concentración de CO2 adecuada para realizar fotosíntesis que sustente su crecimiento. Por ello los carbohidratos proporcionan la energía metabólica y los esqueletos carbonados necesarios para la biosíntesis de aminoácidos y proteínas, polisacáridos estructurales como celulosa, etc.

La sacarosa es el carbohidrato más utilizado en la preparación de medios de cultivo. Las concentraciones varían dentro de ciertos rangos de acuerdo al tipo de respuesta esperada, la más utilizada es de 3% p/v. Otros azúcares como fructuosa, glucosa, celobiosa, maltosa, rafinosa y galactosa son recomendados para algunas especies en particular.

• Vitaminas

     Las vitaminas, en la mayoría de los casos, cumplen funciones de cofactores de reacciones enzimáticas (tiaminafosfato, piridoxina), en otros se comportan como sustrato de reacciones metabólicas (ácido nicotínico). La combinación de vitaminas en el medio de cultivo se definió a partir de los primeros estudios de cultivo de raíces. La composición vitamínica, en el caso de medio MS, está constituida por tiamina (Vitamina B1), ácido nicotínico (niacina) y piridoxina (vitamina B6), a la que normalmente se le adiciona el aminoácido glicina. Las concentraciones más usuales oscilan entre 0.1 a 0.5 mg por litro de solución de medio. Otros compuestos utilizados son: ácido ascórbico, ácido fólico, riboflavina y biotina. En todos los casos las variaciones en la formulación está dada por la especie utilizada y la respuesta buscada.

• Mio inositol

El mio inositol es una hexosa cíclica hidroxilada, que  se incorpora al medio MS y a la mayoría de los medios de cultivo usados en la actualidad. Su presencia es necesaria en todas las células para lograr la ciclación de la glucosa. Debido a que la biosíntesis no siempre se verifica in vitro, se hace imprescindible su incorporación a los medios. Posee efecto estimulador para el crecimiento de callos y en la organogénesis directa de algunas especies. Se usa en concentraciones de 100 mg/l. Actualmente se sabe que el myo-inositol se incorpora a las moléculas de fosfolípidos de la membrana plasmática. Otra función estaría asociada a la conjugación de auxinas, formando un complejo auxina-inositol, que es inactivo como regulador de crecimiento.

• Hormonas Vegetales y Reguladores de Crecimiento.

Las hormonas son compuestos orgánicos, no nutrientes, sintetizados por la planta, que actúan en muy baja concentración (10–6M-10-8 M) y que desencadenan diversas respuestas fisiológicas. Se caracterizan por expresar su acción en lugares distantes de su sitio de síntesis. Existen sustancias sintéticas, con similares características, a las que se denomina reguladores de crecimiento. En ambos casos se trata de moléculas de relativamente bajo peso molecular (28 Da a 346 Da)

Las hormonas vegetales se agrupan en 5 clases, fundamentalmente en base a su acción fisiológica:

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