Tarea 2 laboratorio de biología molecular de extracción de ARN

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Biología                        Molecular-Laboratorio.
2021

Identificación del estudiante:

INSTRUCCIONES

1. Sugerencias de estrategias de trabajo

• Revisar los recursos de aprendizaje (Clases y audios) a su disposición en la plataforma, así como la bibliografía del curso u otra externa y válida sobre el tema.
• Antes de realizar su trabajo revise como será evaluado(a).

1. Debe cumplir con los siguientes aspectos formales:

• Utilizar el presente formato para desarrollar la tarea y ser subida en formato PDF.
• Seguir las instrucciones de la tarea en el orden solicitado.
• Ocupar letra Arial, tamaño 12, interlineado 1,5.
• La extensión máxima del documento es hasta 7 páginas, sin contar portada e instrucciones del mismo ni la bibliografía.
• Uso adecuado de citas y referencias según norma APA.

1. Evaluación

• Enviar esta tarea a más tardar a las 23:55 horas del domingo 02 de mayo.
• Esta actividad debe ser realizada por grupo de 2 alumnos de la misma sección.
• Esta actividad es obligatoria
• Será evaluado(a) a través de una rúbrica.

1. Rúbrica

• Integra de forma pertinente los conceptos clave de cada uno de los aspectos relativos a conceptos de extracción.

• Infiere correctamente los contenidos relevantes y su relación al contexto del trabajo

• Emite juicios fundamentados y pertinentes para las observaciones efectuadas.
  
• Utilización correcta de normas APA en el texto y en la bibliografía.

DESARROLLO

1. A través de un protocolo genérico de extracción de ARN desde una matriz vegetal, fundamente el uso de los reactivos, insumos y/o equipos (no enumerar pasos ni cantidades).

Aislamiento de ARN de Platycladus orientalis

“Platycladus orientalis tiene una vida útil de varios miles de años en China, lo que la convierte en una buena planta para estudiar el envejecimiento a nivel molecular, pero esto requiere cantidades suficientes de ARN de P. orientalis de alta cantidad” 1 . Con respecto al método experimental utilizado, abordaremos el protocolo mejorado del Kit de RNAout de plantas ya que este método produce niveles elevados de RNA de alta calidad.

Una vez preparadas las condiciones experimentales para este procedimiento, el P. orientalis obtenido fue pulverizo y homogenizado con nitrógeno líquido para buscar “eficiencia en el manejo del tiempo y calidad del ARN en la evaluación de la expresión génica” 2 , en otras palabras, el uso de nitrógeno líquido se utiliza como primera instancia para la ruptura celular y así obtener el contenido intracelular siendo uno de los pasos más críticos para obtener un ARN  total con buen rendimiento y calidad. Además, el nitrógeno liquido tiene la capacidad de “congelar de inmediato la muestra y así evita que se formen cristales en el interior de la célula”3.

 A la muestra se le agrego el aditivo polivinilpirrolidona (PVP) para la absorción de los polifenoles durante la purificación. “Cuando los polifenoles son liberados durante la lisis celular, disminuye la calidad y rendimiento debido a que mediante la polifenoloxidasa con su actividad catecolasa, los polifenoles se oxidan a quinonas y se acoplan covalentemente con los ácidos nucleicos degradándolos o provocando que precipiten con ellos” 4.

La muestra obtenidas son vertidas luego en tubos Eppendorf para ser llevadas a la centrifuga, equipo que ayuda a acelerar el proceso de separación de componentes de diferentes densidades por medio de una fuerza giratoria. El uso de tampones de extracción (β-mercaptoetanol) en este método se utiliza para inhibir la actividad de RNAsa y prevenir la oxidación de la muestra. Además se añadió a este método altas concentraciones de sal (Citrato de sodio, KAc) para eliminar los polisacáridos del tejido vegetal y así junto con el tampón de extracción mas la incubación de las muestras en hielo, se evitó la precipitación de los polisacáridos junto con el ARN. Es importante mencionar en este punto que las altas concentraciones de sal tambien inactivan las RNAsas.

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