Tarea 2

Tarea 2

1.- Buscar 4 métodos de extracción de DNA con plantas y mencionar sus usos en el buffer de extracción.

Métodos de extracción de DNA vegetal

Método 1.

Micrométodo de extracción de ADN basado en CTAB-SDS

Reactivos:

Amortiguador de extracción A: (CTAB 2X: Tris HCl 100mM pH8, EDTA 20Mm, NaCl 1.4M, PVP40 4%, ácido ascórbico 0.1% y 2 ǃ–mercaptoetanol 10mM).

Amortiguador de extracción B:( Tris-HCl 100mM pH 8, EDTA 50mM, NaCl 100mM , 2–mercaptoetanol 10mM).

Amortiguador TE: Tris 10mM, EDTA 1mM. SDS 20%. Acetato de potasio 5M (-20°C). Acetato de sodio 3M pH5.2. Etanol 70% (-20°C). Isopropanol absoluto (-20°C).

Procedimiento:

Colocar el tejido vegetal en un mortero y pulverizar con ayuda de nitrógeno liquido. Transferir a un tubo eppendorf. Añadir 300 µl de amortiguador A, 900 µl de amortiguador B y 100 µl de SDS.

Agitar e incubar en baño maría a 65ºC por 30 minutos. 3. Añadir 410 µl de acetato de potasio frío, agitar vigorosamente. Centrifugar a 8000 g durante 15 minutos a 4°C.

Transferir 1ml de sobrenadante a un tubo eppendorf limpio. Añadir 800-900 µl de Isopropanol frío. Incubar a -20ºC por 20 min. 5. Centrifugar a 6 000 g por 10 minutos. Descartar el sobrenadante, lavar la pastilla con 500 µl de etanol al 75% y dejar secar.

Resuspender la pastilla en 800 µl de amortiguador TE. Incubar a 37°C durante 15 minutos..

Añadir 800 µl de cloroformo:isoamílico (24:1) y agitar vigorosamente.

Centrifugar a 6000 g por 10 minutos a 4°C.

Recuperar el sobrenadante y añadir 70 µl de acetato de sodio 3M pH 5.2 y 500 µl de isopropanol frío. Incubar a -20ºC por 1 hora.

Centrifugar a 6000 RPM por 10 minutos.

Lavar la pastilla con 1 ml de etanol al 75% y dejar secar. 12. Disolver en 100 µl de TE.

Método 2. Doyle y Doyle (1990)

Soluciones:

o Solución de extracción [CTAB 2%, NaCl 1.5 M, EDTA 20 mM (pH 8), Tris 100 mM (pH 8) y 2-mercaptoetanol 2%], adicionado inmediatamente antes de su uso.

o Solución de lavado [etanol al 76%, acetato de amonio 10 mM].

o Solución TE 1X [Tris-HCl 10 mM y EDTA 1mM].

o Solución de Cloroformo–alcohol isoamílico (24:1, V/V)

o Isopropanol absoluto

o Solución de ARNasa (10 mg/ml)

Procedimiento:

Se congelaron 0.2 g de tejido en un ultracongelador, se pulverizó la muestra en un mortero y se colocó en un tubo para microcentrífuga, se le agregaron 800 μl de solución de extracción recién preparada y se incubó a 65°C en baño María. Se centrifugó a 10,000 rpm durante 10 min en una centrífuga marca Eppendorf, y se transfirió la fase acuosa (superior) a un tubo nuevo.

Inmediatamente se agregó un volumen igual de cloroformo–alcohol isoamílico y se mezcló por inversiones suaves. Se volvió a centrifugar a 10,000 rpm por 10 min y se separó nuevamente la fase superior en un tubo nuevo. Para la eliminación de ARN se trató con ARNasa (10 mg/ ml) incubando durante 30 min. a 37°C. En seguida se agregaron 800 μl de isopropanol a -20°C, y se colocó una hora en el congelador para precipitar el ADN. Para formar la pastilla de ADN, se centrifugó nuevamente a 10,000 rpm por 10 min. Se tiró el sobrenadante, se lavó la pastilla con 400 μl de solución de lavado una y otra vez, con 400 μl de alcohol al 70%. Se dejó secar a temperatura ambiente y se resuspendió en una cantidad 1:1 de solución TE 1X.

Método 3. Método Graham et al. (1994).

Soluciones:

o Solución de extracción [CTAB 2%, NaCl 1.5 M, EDTA 20 mM (pH 8), Tris 100 mM (pH 8) y albúmina sérica bovina al 2%)

o Solución de cloroformo-alcohol isoamilico (24:1, V/V)

o Acetato de amonio 7.5 M

o Etanol absoluto

o Etanol al 70%

o Solución TE 1X [Tris-HCl 10 mM y EDTA 1mM].

Procedimiento:

Se congelaron 0.2 g de tejido en un ultra congelador , se pulverizó la muestra en un mortero y se colocó en un tubo; se agregó 1 ml de solución de extracción y se mezcló e incubó a 55°C durante 20 min.

Posteriormente se centrifugó a 10,000 rpm en una centrífuga, se transfirió el sobrenadante a otro tubo, se agregó un volumen de cloroformo-alcoholisoamílico, se mezcló por inversiones suaves y se volvió a centrifugar. Se separó nuevamente la fase superior, se le agregó 1/10 de volumen de acetato de amonio al 7.5 M y dos volúmenes de etanol congelado. Se mezcló suavemente y se colocó en el congelador para precipitar. Se volvió a centrifugar a las mismas condiciones, se decantó y lavó la pastilla con alcohol al 70%. Se dejó secar a temperatura ambiente y por último se hidrató con solución TE 1X.

Método 4

Puregene® DNA purification kit (Gentre syste0ms)

Soluciones:

o Solución de lisis

o Solución de ARNasa al 10 %

o Solución de precipitación de proteínas

o Isopropanol absoluto

o Etanol al 70%

o Solución TE 1X.

Procedimiento:

Se congelaron 0.03 g de tejido en un ultracongelador, se pulverizó la muestra en un mortero y se colocó en un tubo Eppendorf de 1.5 ml y 300 μl de la solución de lisis. Se mezcló e incubó a 65 °C durante 60 min, se agregó ARNasa a una concentración final de 10 mg/ml y se mezcló por inversiones suaves e incubó a 37°C durante 20 min.

Se agregaron 100 μl de solución de precipitación de proteínas, se mezcló por inversiones y se colocó en

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