Tipificacion De Listeria

Introducción

La tipificación de Listeria spp., Especialmente L. monocytogenes,

es de gran importancia en la vigilancia de

posible de la comunidad de origen alimentario o brotes nosocomiales

infecciones cruzada episodios de la listeriosis, y como

herramienta de investigación. Varios sistemas de Tipificación se han

desarrollado pero ninguno ha dado más de un parcial

conocimiento de la ecología y epidemiología de la

Listeria spp. Biotipificación, resistogram y monocin

Tipificación parecen ser de poco valor, o no han sido

investigados ampliamente. Serotipificación ha sido utilizada

desde principios de los 1 9 4 0, y parece ser un sistema fiable, pero el método no es especialmente discriminatorio. Aunque hay 13 serotipos de L. monocytogenes, casi el 90% de los aislados en el Reino Unido de una infección humano pertenecen al serotipo 1/2a, 1/2b o 4b, con el c. 60% perteneciente a serovar 4b. En consecuencia, el nivel de discriminación logrado con serotipificación es baja. Tipificación de bacteriófagos se ha empleado para confirmar infecciones grupos de la comunidad y el hospital la infección cruzada, y para vigilar aislamiento humano. Sin embargo, sólo c. 64% de las cepas humanas obtenidas en el Reino Unido entre 1967 y 1983 fueron tipificables-37% del serogrupo 1 / 2 y el 82% del serogrupo 4. Tipificación de fagos también se ha utilizado al tipo L. innocua. Separación de enzimas multilocus por electroforesis y el análisis de ADN de plásmido y cromosómicas, también han sido evaluadas.

La determinación de perfiles de plásmidos proporciona información epidemiológica útil

, Pero sólo el 1,7% de los aislamientos de L. monocytogenes de infección humana en el Reino Unido se encontró que contienen plásmidos (observaciones no publicadas). Aunque la L. monocytogenes aisladas de otros países, y de aislamientos de L. innocua tienen una mayor incidencia de transporte plásmido, la incidencia del transporte plásmido es insuficiente para servir como una base para un método de caracterización general. La investigación de ADN cromosómico, ya sea mediante el análisis con endonucleasas de restricción (REA) o por el uso de sondas de ADN marcadas con digoxigenina, se ha utilizado para investigar los brotes de cepas obtenidas de los alimentos y hospitales de la listeriosis, y para distinguir las cepas de L. monocytogenes, que no pueden ser fagotipado. Este planteamiento ha mostrado discriminar entre las cepas de L. monocytogenes 4b serotipo.

Estudios anteriores han demostrado que la polimerasa

reacción en cadena (PCR), con el gen de primers específicos, se puede detectar L. monocytogenes presente en los alimentos. En una variante de la PCR, llamada aleatoria de ADN polimórfico amplificado (RAPD), se usan primers de la secuencia elegida arbitrariamente, en lugar de dos primers específicamente diseñados. Cualquier secuencia corta será suficiente y una o se pueden añadir otras en una reacción

mezcla. El método tiene el potencial para tipificar, ya que aprovecha el hecho de que, para cualquier secuencia dada de oligonucleótidos cortos, Los genomas de bacterias y los organismos superiores son susceptibles de contener muchas secuencias parciales y no completas, homologa a el primer. Bajo estrictas condiciones de no-el primer se recoce con las secuencias con diferentes grados de estabilidad, según lo determinado por el número de enlaces de H que se pueden formar entre el primer y en particular una parte secuencia homóloga. Si dos de estos complementarios secuencias se encuentran muy juntos en el genoma en cadenas opuestas, y ambas tienen la misma polaridad, la amplificación de PCR después de la intervención secuencia puede ocurrir en condiciones que permitan la imprimación para hibridarse a ambas secuencias. La distribución de estas secuencias parcialmente complementarias es al azar, y por lo tanto el resultado de la PCR es un conjunto de secuencias de ADN amplificado al azar polimórficos. Cambios de una sola base puede destruir la capacidad de una secuencia de recocido para la imprimación, o puede crear un sitio de unión del cebador nuevo. Por lo tanto, el patrón de secuencias amplificadas se obtiene de imprimación y una cepa específica, y constituye

un perfil de la identidad del organismo. La identidad clonal es se refleja en los aislados con los patrones de la misma banda con cualquier imprimación particular. La deriva genética es vista como cambios discretos en los patrones de bandas. Las diferentes especies de rendimiento diferentes patrones de bandas. En este trabajo se informe sobre la aplicación del análisis de RAPD para la tipificación de Listeria spp.

MATERIALES Y METODOS

Almacenamiento de la cepa bacteriana, la cultura y la preparación del ADN

Las cepas de Listeria spp. fueron almacenadas en Dorset huevo Medio (el sur de los laboratorios del Grupo, Corby) en 4 ° C oa -70 ° C sobre perlas plástico. Los cultivos fueron siembran por estría en Agar triptosa fosfato de (Oxoid) y incubaron durante 18 horas a 37 ° C. Única colonias fueron

recogido, sembradas en el mismo medio y se incubaron durante 24 horas a 37 º C.

Varias colonias fueron recogidos y suspendido en microlitros 15-20 de agua estéril. La suspensión fue hervida después de 3-5 minutos para lisar las células y el ADN de liberación. Muestras calentadas se centrifugaron durante 20 s en una microcentrífuga banco de restos celulares de pellets. El sobrenadante fue utilizado directamente como fuente de la molde de DNA. No se trató de cuantificar las concentraciones de ADN.

Cartilla de ADN

Los primers utilizados en este trabajo (sintetizados en el Departamento de Bioquímica de la Universidad de Bristol) fueron diseñados para los estudios de ADN la secuencia de otros

proyectos no relacionados con este trabajo y fueron escogidos al al azar de varias disponibles. Los cebadores utilizados fueron: no. 1, 5 'TTATGTAAAACGACGGCCAGT-3' (imprimación universal), no. 2, 5 '-GGGCGTTGTCGGTGTTCATG 3 '(cebador 43.423); no. 3, 5 '-ACAGGTCCAACAAAAGCTGG

3 '(cebador 59644). Primer uno es el universal cebador de secuenciación; cebador 2 es un cebador de secuenciación de Tn21, y el primer3 es un cebador de secuenciación del gen de ampC

Citrobacter diversus (primers 2 y 3 fueron obtenidos por cortesía de la señorita Pate1 Rámila y el Sr. M. Jones, respectivamente, del Departamento de Patología y Microbiología, Universidad de Bristol).

Las condiciones de amplificación

Las reacciones de amplificación se realizaron en una reacción

mezcla (volumen final de 50 pl) que contiene: 10mM tris-HCl ,pH 9.0 1.5 mM mgCl2; 50 mM KCl; gelatina 0,1% w / v; Triton XlOO 0,1% w / v,

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