Trabajo Práctico 1&2: Extracción de ADN

Trabajo Práctico 1&2: Extracción de ADN

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Introducción

La mayoría de las bacterias tienen un único cromosoma circular cuyo tamaño puede oscilar entre sólo 160.000 pares de bases y 12.200.000 pares de bases. A su vez, en las bacterias también se pueden encontrar los plásmidos, moléculas circulares extracromosómicas de DNA doble cadena que se encuentran superenrolladas con un tamaño que varía desde pocos miles de pares de bases hasta más de 100.000 pares de bases. Debido a esta diferencia de longitud entre los dos ADN, la extracción del ADN cromosómico debe ser más controlada y menos violenta que la del plasmídico, ya que no se quiere que se rompa la forma circular del primero, que más tarde se va a enrollar en la varilla, no asi sucediendo con los segundos más pequeños que se aislaran de otra manera.

1. Objetivos

* Extracción de ADN cromosómico de Escherichia Coli a través de una lisis suave y controlada.

* Extracción de ADN plasmídico de Escherichia Coli a través de una lisis violenta.

* Comparación entre ambos métodos.

1. Metodología

i. Parte 1: Extracción de ADN cromosómico de Escherichia Coli

Se partió de un tubo con 2 ml de bacterias Escherichia Coli con buffer Tris-HCl 50 mM (pH=8) y sacarosa (25% p/v) que se colocó en hielo. Este último redujo la actividad enzimática de las dnasas, impidiendo la degradación del ADN durante la primera etapa del proceso.

En cuanto al buffer y la sacarosa, se emplearon para mantener el pH del medio en el caso del buffer y movimientos bruscos de agua al crear un medio isotónico respecto de las bacterias en el caso de la sacarosa, evitando así una lisis abrupta y descontrolada.

Se agregaron 0,8 ml de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) con el objeto de que quelara cationes divalentes tales como el Mg2+ y el Ca2+, con la doble función de inhibir el funcionamiento de las dnasas y desestabilizar la membrana de las bacterias, ya que tales cationes presentes en la membrana le otorgan estabilidad.

Se revolvió la solución y se la dejó descansar durante 10` para luego agregarle 0,4 ml de lisozima, la cual corta enlaces de peptidoglicano, presente en la pared celular de las bacterias. A partir de este momento, se comenzó a trabajar a temperatura ambiente.

Pasados otros 10`, se vertieron 0,4 ml de Triton X-100 9% (v/v) a la solución, un detergente suave el cual solubiliza fosfolípidos. Esto, junto con los pasos anteriores, permitió una ruptura controlada de la pared y membrana celular. Se dejó descansar durante 30`.

A continuación, se le agregaron a la solución 0,4 ml de acetato de sodio 3M (pH=5.2), una sal cuyos iones estabilizaron las moléculas de ADN al interactuar con sus grupos fosfato expuestos, evitando que estos se repelieran entre sí. Se mezcló con una varilla el contenido del tubo de ensayo y se lo transfirió a un vaso de precipitados de 50 ml.

Finalmente, se le agregaron 10 ml de etanol frío a la solución, lo que produjo que el ADN precipite formando hebras las cuales se enrollaron en la varilla de madera gracias a su longitud. La varilla con el ADN se la depositó en un nuevo tubo de ensayo con 10 ml de etanol 70% (v/v) para así purificar el ADN de las sales agregadas en pasos anteriores ya que el etanol posee una polaridad media que disuelve tales sales - ver figura 2-.

i. Parte 2: Extracción de ADN plasmídico de Escherichia Coli

Se recibió un pellet correspondiente a 1.5 ml de un cultivo bacteriano en fase estacionaria de una cepa de E. coli conteniendo un plásmido de alto número de copias, resuspendido en 0.3 ml de la Solución 1, de resuspensión (Tris-HCl pH 8 50 mM EDTA 10 mM).

Debido a que los plásmidos no son esenciales para la supervivencia de las bacterias, sino que brindan ventajas adaptativas, antes de recibir los tubos de eppendorf el cultivo de bacterias fue tratado con antibióticos para obtener bacterias que poseyeran el plásmido de alto número de copias, pBluescript, con el que se deseaba trabajar.

Como se mencionó anteriormente, el buffer se empleó para mantener el pH del medio constante y el EDTA para desestabilizar la membrana e inhibir enzimas de las bacterias. A diferencia de la experiencia anterior, no se agregó sacarosa. Por lo tanto, las E-Coli estaban suspendidas en un medio hipertónico, haciendo que el agua ingresara en las bacterias, contribuyendo a que se llevará a cabo la lisis agresiva una vez agregada la solución 2.

Se le agregó al tubo de eppendorf la Solución 2, de lisis alcalina (NaOH 200 mM, SDS 1%). Similar a la experiencia anterior, se empleó detergente durante el proceso. Sin embargo, se empleó SDS, un detergente iónico fuerte, el cual permitió el acceso al ADN al crear micelas y solubilizar los fosfolípidos además de romper uniones covalentes, desestabilizando la estructura tridimensional de las bacterias.

En cuanto al NaOh, produjo un aumento abrupto del pH, desnaturalizando tanto ADN plasmídico como proteínas y ADN genómico. Sin embargo, las hebras de ADN plasmídico y genómico son químicamente iguales pero cuantitativamente diferentes. Al ser considerable la diferencia de tamaño entre el ADN genómico y el plasmídico, el primero se fragmentó, separándose así sus hebras mientras que el plasmídico se mantuvo físicamente unido al no fragmentarse debido a su tamaño reducido.

En este momento el color del contenido del tubo pasó de ser turbio a transparente gracias a las lisis bacterianas.

A continuación, se le agregaron 0,3 ml de Solución 3, de renaturalización (K+AcO- 3M pH 4.8) con el objeto de renaturalizar el ADN plasmídico, separándolo del genómico. El K+AcO- neutralizó el pH básico de la solución, además de evitar la repulsión entre hebras de ADN, facilitando su renaturalización. Por otro lado, los iones K+ disminuyeron la solubilidad del detergente al reemplazar el Na+.

Al ser tan

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