Un nuevo papel para los metabolitos secundarios de Trichoderma en la interacción con plantas

Un nuevo papel para los metabolitos secundarios de Trichoderma en la interacción con plantas

RESUMEN

Los metabolitos secundarios juegan un papel variable en las actividades antagonistas de algunas especies biocontrol de Trichoderma dando como resultado la supresión de patógenos de plantas, pero no se ha estudiado específicamente su implicación con las plantas. En este trabajo la mayoría de los metabolitos secundarios producidos por cepas biocontrol de Trichoderma (T. harzianum cepas T22, T39 y A6, y T. atroviride cepa P1) han sido investigados por su efecto sobre la promoción de crecimiento en plantas. Se observó una actividad similar a la de la auxina en tallos de un guisante etiolated (Pisum sativum) tratados con harzianolida y 6-n-pentyl-6H-pyran-2-one (6PP), que también afectó el crecimiento de semillas de arbustos como el tomate (Lycopersicum esculentum) y la canola (Brassica napus). También se investigó la habilidad de estas moléculas para inducir respuestas de defensa sistémica en planta. El tomate y el aceite de semillas de colza fueron tratados con los metabolitos y luego inoculados con una suspensión de espora de Botrytis cinerea o Leptosphaeria maculans, respectivamente. En ambos casos, se observó una reducción de síntomas de enfermedad, particularmente en las plantas tratadas con 6PP. Además, se detectó también una sobreexpresión de proteínas relacionadas con patogénesis (PR) en plantas tratadas. Estos resultados indican claramente que los metabolitos secundarios de Trichoderma spp. pueden tener un papel tanto en la regulación de crecimiento como en la activación de respuestas de defensa en plantas.

Introducción

Los metabolitos secundarios son un grupo heterogéneo de compuestos naturales que son considerados como ayudantes de los organismos en la supervivencia y en funciones básicas, como en competencia, simbiosis, transporte de metales, diferenciación, etc. Debido a las propiedades químicas y biológicas de tales compuestos, son ampliamente usados con fines médicos, farmacéuticos, o agrícolas. Este grupo incluye antibióticos, que son productos naturales capaces de inhibir el crecimiento microbiano, y son producidos por varios microbios durante los procesos de desarrollo y esporulación.

Los hongos del género Trichoderma son agentes biocontroladores (BCAs) que son usados exitosamente como biopesticidas en todo el mundo, y muchas especies son bien conocidas como productoras de metabolitos secundarios con actividad antibiótica. La producción de antibióticos se combina generalmente con otros mecanismos de biocontrol [como micoparasitismo y la producción de enzimas degradadoras de pared celular (CWDEs), la competencia por nutrientes/espacio, y la resistencia inducida en la planta] y así se considera que se involucra en interacciones de Trichoderma con la planta hospedera y los efectos benéficos resultantes.

La producción de metabolitos secundarios en Trichoderma spp. es dependiente de la cepa e incluye sustancias antifúngicas volátiles y no volátiles, tales como 6-n-pentyl-6H-pyran-2-one (6PP), gliotoxina, viridina, harzianopyridona, harziandiona y peptaibols. Los efectos sinérgicos entre las CWDEs y las diferentes clases de antibióticos sobre el crecimiento de patógenos fúngicos han sido bien documentados.

El efecto global de biocontrol de Trichoderma spp. fue significativamente reforzado mediante la estimulación de las respuestas de defensa de la planta al ataque patógeno. Además, la inoculación del hongo vivo antagonista produjo un efecto promotor de crecimiento in planta. Sin embargo, el papel que los metabolitos secundarios produjeron a través de los BCAs, así como el que juega Trichoderma en el complejo de interacción de tres vías entre plantas, patógenos y hongos antagonistas ha recibido muy poca atención.

En este trabajo, nosotros aislamos la mayoría de metabolitos secundarios producidos en cultivo líquido de diferentes cepas biocontrol de Trichoderma (cepas comerciales T22 y T39 de T. harzianum, T. atroviride P1 y T. harzianum A6). Se extrajeron, aislaron y caracterizaron siete compuestos conocidos a partir del filtrado del cultivo fúngico: (1) T22azaphilona; (2) T39butenolido; (3) harzianopyridona; (4) harzianolida; (5) 1-hydroxy-3-methyl-anthraquinona; (6) 1,8-dihydroxy-3-methyl-anthraquinona; y (7) 6PP. Los efectos sobre el crecimiento de la planta y la inducción de mecanismos de defensa de los metabolitos purificados fueron determinados in vivo.

Materiales y Métodos

1. Condiciones de cultivo y de cepas microbianas

Los fitopatógenos Rhizoctonia solani, Pythium ultimum y Gaeumannomyces graminis var. Tritici, así como los hongos antagonistas T. harzianum cepas T22, T39 y A6 y T. atroviride cepa P1 fueron mantenidos en agar papa dextrosa (PDA, SIGMA, St Louis, MO) condicionados a temperatura ambiente y a monitoreos de subcultivos. Similarmente, UWA P11 aislado de Leptosphaeria maculans se sembraron en cajas con agar V8 y se cultivaron como se describió antes. Los patógenos fueron aislados de cosechas de campo del occidente de Australia.

2. Producción y aislamiento de metabolitos secundarios de Trichoderma

Se obtuvieron dos tapas de 7 mm de diámetro de cada cepa de Trichoderma de márgenes activamente crecientes de cultivos de PDA y se inocularon con frascos cónicos de 5 L que contenían 1 L de caldo papa dextrosa estéril 1/5 (PDB, SIGMA). Los cultivos estacionarios se incubaron a 25°C durante 31 días. Los cultivos se filtraron al vacío a través de papel filtro (Whatman, Brentford, UK). El caldo de cultivo filtrado de T. harzianum T22 y T39 se extrajo y se trató como se describió previamente. El caldo de cultivo filtrado (2 L) de T. harzianum A6 se extrajo exhaustivamente con acetato de etilo (EtOAc). El residuo café rojizo obtenido estuvo sujeto a una columna cromatográfica rápida (Si gel; 50 g), diluyendo con un gradiente de éter de petróleo EtOAc:petróleo (1:1 a 1:10). Las fracciones que mostraron perfiles cromatográficos de capa delgada (TLC) similares se combinaron y se purificaron más adelante mediante el uso de un preparativo de separación de TLC (Si gel; éter de petróleo EtOAc:petróleo; 6:4).

...