Administracion

HPLC

1) Componentes de passiflora detectados (aunque sea trazas) y tiempos de retención

2) Columna analítica

3) Fase móvil

4) Preparación de la muestra

5) Longitud de onda

6) Cromatogramas

FLAVONOIDES

1) Componentes de Passiflora detectados (aunque sea trazas) y tiempos de retención

En el presente trabajo se orientó la búsqueda de compuestos activos a través de

resultados obtenidos en ensayos bioguiados realizados previamente por los autores. En

estos trabajos se determinó que la acción antiulcerosa, exhibida por los extractos

metanólicos de Centaurea solstitialis, estaba mediada por mecanismos citoprotectores y

una diminución de la motilidad gástrica. Evidencias tales como la solubilidad en

metanol de los flavonoides, la caracterización de éstos en el extracto metanólico y la

presencia de compuestos con propiedades citoprotectora y espasmolítica en este grupo,

permitieron investigar la posible presencia de apigenina, rutina, canferol y quercetina.

Di Carlo et al. (1993), demostraron que la rutina, quercetina y apigenina,

retrasan el tránsito intestinal, considerando que estos compuestos actuarían de la misma

forma sobre la musculatura lisa gástrica se investigó su posible presencia en el extracto

metanólico de Centaurea solstitialis. Además, se analizó la probable presencia de

canferol, compuesto con reconocida acción citoprotectora y miolítica.

El aislamiento por HPLC e identificación por espectrometría de masas de

canferol en la fracción metanólica (Fig. 3 B y 5 A respectivamente), permitieron

confirmar la presencia de este compuesto y realizar estudios cuantitativos que

detectaron 1,47 mg de canferol por gramo de materia seca.

Para el aislamiento de canferol y quercetina a partir de la fracción acetato de

etilo, como se describe en Materiales y Métodos, se realizó una hidrólisis de la fracción

metanólica con ácido clorhídrico para separar los glicósidos. Este procedimiento

permitió el aislamiento de canferol y quercetina libres. La presencia de rutina se

investigó antes del agregado del ácido clorhídrico a la fracción metanólica, ya que la

hidrólisis de este flavonoide da quercetina (Fig. 6).

2) Columna analítica

Para el aislamiento se utilizaron solventes de alta calidad (HPLC), (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ, EE.UU.). Los cromatofolios fueron provistos por Whatman Inc.

(Clifton, NJ, EE.UU.). Los cartuchos LiChroCART y los guardacolumnas LiChrospher

100 RP-18 (5 µm) para los análisis por HPLC fueron provistos por Merck (Darmstadt,

Alemania). Todos los reactivos utilizados fueron de grado analítico. Los estándares

auténticos de apigenina, rutina, canferol y quercetina fueron provistos por Sigma (St.

Louis, EE.UU.).

3) Fase móvil

Cada fracción fue resuelta por HPLC con un equipo Isco Model 2360 de gradiente programable, equipado con un detector Model Isco V4 de longitud de onda multivariable y una bomba Isco Model 2350 (Isco, Lincoln, EE.UU.). Se utilizó un

cartucho de fase reversa LiChroCART (4 x 250 mm) con guarda columna fase reversa

LiChrospher 100 RP-18. Ambos compuestos fueron eluídos con 15-100 % metanol en

agua durante 35 minutos.

4) Preparación de la muestra

Material vegetal

Los capítulos de Centaurea solstitialis (n.v. Abrepuño; Cs), (Asteraceae), fueron

colectados en el Departamento Maracó (Provincia de La Pampa), entre los meses de

enero y febrero de 2000. La planta fue autenticada por el Dr. Carlos Villamil del

Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia (UNS), Bahía Blanca. Un ejemplar

ha sido depositado en el Herbario de la Facultad de Agronomía (UNLPam), Santa Rosa

(R. Toso 1, SRFA).

Extracción

Se mantuvo en ebullición 20 g de capítulos secos de Cs con 200 ml de agua

destilada durante 20 minutos (2x). Los extractos se redujeron a presión reducida hasta

consistencia butirosa obteniéndose un rendimiento de 36,74 % de extracto acuoso seco.

20Ciencia Veterinaria. Facultad de Ciencias Veterinarias. U.N.L.Pam. – 2002

El residuo fue resuspendido con metanol (3 x 10 ml). Los extractos fueron llevados a

sequedad a presión reducida obteniéndose un rendimiento de 15,95 % de extracto

metanólico seco. Este extracto fue resuspendido con 10 ml de agua destilada y 25 ml de

HCl 2 N y colocado en baño maría durante 20 minutos para hidrolizar los glicósidos de

los flavonoides. La fracción fue colectada, filtrada y extraída con 10 ml de acetato de

etilo (3x). La fracción acetato de etilo fue llevada a sequedad en rotavapor dando un

rendimiento de 0,44 %. Los distintos extractos dieron resultados positivos a las

reacciones de caracterización de Shinoda (Shinoda, 1928) y cloruro férrico (Geissman,

1962), revelando la presencia de grupos fenólicos característicos de los flavonoides.

Esta fracción fue utilizada para sembrar en placas de capa fina, las bandas

correspondientes a Rfs iguales a 0,80 y 0,89 fueron recuperadas, eluídas con metanol y

evaporadas bajo corriente de nitrógeno. Cada fracción fue resuelta por HPLC y luego

identificada por espectrometría de masas. Una alícuota del extracto metanólico seco fue

resuspendido con metanol y cromatografiado en capa fina junto a estándares auténticos

de canferol, quercetina, apigenina y rutina.

Obtención del extracto metanólico

Se utilizaron 10 g de capítulos secos de Cs los cuales fueron extraídos en un

soxhlet durante 6 h utilizando como solvente de extracción 300 ml de metanol. El

extracto fue llevado a sequedad a presión reducida en rotavapor obteniéndose un

rendimiento de 16,25 % de residuo metanólico seco.

Obtención de la fracción acetato de etilo

El residuo metanólico se resuspende con 50 ml de agua destilada y se agregan 50

ml de HCl 2 N. Luego de mantener en ebullición en baño maría durante 1 h se deja

enfriar y se extrae con 50 ml de acetato de etilo (3x). Los extractos se juntan y filtran

con papel de filtro y se llevan a sequedad en rotavapor obteniéndose un rendimiento de

2,8 %.

Espectrometría de Masas

Los compuestos obtenidos por HPLC fueron identificados por espectrometría de

masas utilizando un espectrómetro de masas magnético Micromass Model Autospec

y

...