Cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC)

Cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC)

En este capítulo trata de los cuatro tipos basticos de cromatografía en los que la fase móvil es un líquido:

1. La cromatografía de reparto
2. La cromatografía de adsorción o la cromatografía de líquido-solido
3. Cromatografía Iónica
4. Cromatografía  de exclusión de tamaño o cromatografía en geles

La cromatografía de líquidos de alta eficiencia es la técnica analítica de separación mas ampliamente utilizada, y esto por su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separaciones de especies no volátiles o termolábiles y sobre todo a su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen: aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, terpenoides, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, antibióticos, eteroides, especies organometalicas y una variedad de sustancias inorgánicas.

[pic 1]

Instrumentación para la cromatografía de líquidos

En la figura 28-4 muestra una esquema de los componentes fundamentales de un cromatografía de líquidos de ala eficiencia típico.

[pic 2]

Recipientes

Un aparato moderno de cromatografía de líquidos está equipado con uno o más recipientes de vidrio o de acero inoxidable, cada uno de los cuales contiene de 200 o 1000 ml de un disolvente.

Los recipientes, a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos, en general oxígeno y nitrógeno que interfieren formando burbujas ni las columnas y en los sistemas de detección. Estas burbujas provocan ensanchamientos de banda y a menudo interfieren en el funcionamiento del detector. Un desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vacío, sus sistema de destilación, dispositivos para calentar y agitar las disolventes o como se muestra en la figura 28-4, sistemas de purga que permiten arrastrar los gases disueltos fuera de la solución mediante finas burbujas de gas inerte de baja solubilidad. Con frecuencia estos sistemas también contienen dispositivos para la filtración del polvo y de las partículas solidad en suspensión en los disolventes para evitar que estas partículas dañen la bomba o los sistemas de inyección u obturen la columna.

Sistemas de bombeo

Los requisitos para un sistema de bombeo en cromatografía liquida son rigurosos e incluyen:

1. Generación de presiones por encima de 6,000 psi
2. Un flujo libre de pulsaciones
3. Un  intervalo de caudales de 0.1 a 10 ml/min
4. El control y la reproducibilidad del caudal mejor del .5 por 100 relativo
5. Componentes resistentes a la corrosión (juntas de acero inoxidable o teflón)

Debe subrayarse que las altas presiones que generan las bombas en cromatografía de líquidos no constituyen un riesgo de explosión ya que los líquidos no son muy compresibles, de este modo la rotura de un componente del sistema solo supone una pérdida de disolvente.

Se utilizan tres tipos de bombas, cada una con sus propias ventajas y desventajas:

• Bombas reciprocas
• Bombas de jeringa o de desplazamiento
• Bombas neumáticas o de presión constante

Bombas reciprocas

Las bombas reciprocas que se utilizan en aproximadamente el 90 % de los sistemas de cromatografía liquida comercial, consisten por lo general, en una pequeña cámara en la que el disolvente es impelido por el movimiento de viven de un pistón accionado por un motor de arrastre (figura 28-6). Dos válvulas con cierre de bola, que se abren y cierran alternativamente, controlas el flujo del disolvente hacia adentro y hacia afuera de un cilindro. También se puede comunicar la presión al disolvente mediante un diagrama flexible, el vual a su vez se bombea hidráulicamente por un pistón de vaivén. Las bombas reciprocas tienen la desventaja de que producen un flujo pausado, que se manifiesta como ruido en la línea base del cromatograma. Entre las ventajas se pueden citar su pequeño volumen interno, sus altas presiones de salida (por encima de los 10,000 psi).

[pic 3]

Bombas de desplazamiento

Las bombas de desplazamiento consisten por lo general en unas grandes cámaras como una jeringa, equipadas con un embolo que se activa por un mecanismo de tornillo accionado mediante un motor paso a paso. Las bombas de desplazamientos también producen un flujo que tiende a ser independiente de la viscosidad y de la contrapresión, además el flujo que resulta está libre de pulsaciones.

Bombas neumáticas

En las bombas neumáticas más simples, la fase móvil se encuentra en un recipiente plegable colocado en una vasija que puede presurizarse mediante gas comprimido. Las bombas de este tipo son baratas y están exentas de impulsos; aunque tienen una limitada capacidad y presión de salida, que además el caudal depende de la viscosidad del disolvente y de la contrapresión de la columna. También están limitadas a presiones menores de unos 2,000 psi.

Sistema de inyección de muestra

A menudo, el factor limitante en la precisión de las medidas en cromatografía de líquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El problema se acentúa por el ensanchamiento de banda que acompaña a la sobrecarga de las columnas. Por ello los volúmenes que se emplean han de ser muy pequeños, de unas pocas décimas de milímetro a tal vez 500 microlitros. Además se han de introducir muestras sin despresurizar el sistema.

El medio más simple y antiguo para introducción de las muestras implicaba la inyección con jeringa a través de un elastómero (septum) que cierra herméticamente. Con esta finalidad se utilizaron microjerningas capaces de resistir presiones de hasta 1,500 psi.  En las inyecciones a flujo detenido, el flujo del disolvente se detiene momentáneamente, se retira el conector de la cabeza de la columna y la muestra se inyecta directamente en el relleno de la cabeza de la columna después se retira el accesorio y el sistema se vuelve a presurizar. La ventaja de esta técnica es su sencillez, desafortunadamente la reproducibilidad de la inyección con jeringa  rara vez es mejor de un 2 o 3 % y con frecuencia es considerablemente peor.

...