Cromatografia Liquida

Cromatografía De Intercambio Iónico

La cromatografía de intercambio iónico está basada en la atracción entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria. En el caso de intercambiadores aniónicos, grupos cargados positivamente en la fase estacionaria atraen aniones del soluto. Los intercambiadores catiónicos contienen puntos cargados negativamente que atraen cationes del soluto.

Los intercambiadores iónicos se clasifican en ácidos o básicos, fuertes o débiles. Las resinas ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy ácidas, en cambio las resinas ácidas débiles se protonan a un pH próximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio catiónico. Los grupos muy básicos de amonio cuaternario siguen siendo catiónicos a cualquier valor de pH. Los básicos débiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente básicas y pierden entonces su capacidad.

Las resinas de intercambio iónico tienen aplicación en estudios donde intervienen moléculas pequeñas (PM=500) que pueden penetrar en los poros pequeños de la resina. Los intercambiadores iónicos de poliestireno son tan grandes que las macromoléculas muy cargadas, como las proteínas, se pueden enlazar irreversiblemente a ellos. Los de celulosa y dextranos sirven para intercambio iónico de macromoléculas. Los geles de intercambio iónico se usan en el caso de moléculas grandes (proteínas y ácidos nucleicos). Cuando las separaciones exigen condiciones químicas fuertes se emplean intercambiadores iónicos inorgánicos.

En resumen la gran variabilidad de los métodos cromatográficos se debe a las diferentes condiciones que pueden utilizarse para separar los componentes de una sustancia.

Todas estas técnicas tienen en común la existencia de una fase estacionaria a través de la cual fluye una fase móvil, así como la presencia de un mecanismo de inyección de la muestra y un mecanismo de detección de los diferentes componentes separados.

La electroforesis fue desarrollada por primera vez por el químico sueco Arne Tiselius, merecedor del Premio Nobel en 1948 por sus trabajos realizados en esta esfera.

La electroforesis es una técnica analítica de separación de fundamento cinético basada en el movimiento o migración de las macromoléculas disueltas en un determinado medio (solución tampón de electroforesis), a través de una matriz o soporte reticulado como resultado de la acción de un campo eléctrico. El comportamiento de la molécula viene dado por su movilidad electroforética y ésta por la carga, tamaño y forma de la misma. Cuanto mayor es la relación carga/tamaño más rápido migra un ión en el seno del campo eléctrico.

Esta técnica tiene como ventaja su capacidad de separar macromoléculas de interés en la industria biotecnológica y química. Ha sido un método muy útil para la separación de proteínas (enzimas, hormonas) y ácidos nucleicos (DNA y RNA) con gran resolución.

En un sistema electroforético pueden originarse distintos fenómenos que afectan la separación de las sustancias:

• Difusión

Este fenómeno es provocado por la existencia de gradientes de concentación que favorecen el transporte hacia las zonas de menor concentaración de cada especie. Afecta tanto a partículas cargadas como no cargadas. Las moléculas tienden a moverse de una forma aleatoria debido a que poseen energía cinética propia. Esto es lo que se denomina difusión. Con un aumento de la temperatura aumentará la difusión por un incremento de la energía cinética.

• Migración

Es el movimiento producido por una fuerza externa que es impuesta al medio, en este caso, el campo eléctrico y su intensidad.

• Flujo térmico

Al pasar una corriente eléctrica a través de un sistema que origina una resistencia dada, se produce calor. Por tanto el sistema electroforético no es isotérmico. En general la fase líquida se mueve hacia las zonas de menor temperatura, lo que origina un transporte de las partículas de interés no debido a la migración.

• Fricción

La fricción con el solvente dificultará el movimiento (es decir, al moverse los solutos chocarán con las moléculas del solvente que están en su camino), lo que genera una fuerza que se opone al movimiento.

La suma de todos estos factores provoca que las moléculas no migren de una manera uniforme, de modo que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de la solución, los iones comenzarán a moverse formando un frente cuya anchura aumentará con el tiempo. Para reducir esta anchura podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga más resistencia a dicho movimiento.

Esta situación nos permite diferenciar dos métodos electroforéticos:

• Electroforesis convencional

• Electroforesis capilar.

La cromatografía de intercambio iónico (o cromatografía iónica) es un proceso que permite la separación de iones y moléculas polares basado en las propiedades de carga de las moléculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molécula cargada, incluyendo grandes proteínas, pequeños nucleótidos y aminoácidos. La solución que debe inyectarse es usualmente llamada "muestra" y los componentes separados individualmente son llamados analitos. Es usada a menudo en purificación de proteínas, análisis de agua o control de calidad.

Técnica típica

Un muestra es introducida, de forma manual o con autosampler, dentro de un ciclo de muestras de volumen conocido. Una solución buffer acuosa conocida como fase móvil del bucle a la columna que contiene alguna forma de material en fase estacionaria. Esto es típicamente una resina o matriz de gel que consiste en agarosa o celulosa unido a grupos funcionales cargados. Los analitos objetivo (aniones o cationes)

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