INTRODUCCIÓN VALIDACIÓN DE UNA TÉCNICA DE ANÁLISIS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)

I. INTRODUCCIÓN

La asociación Norfloxacino 400 mg y Fenazopiridina 50 mg en una forma farmacéutica oral ya se expende en el mercado farmacéutico del país como un antibacteriano – analgésico urinario de administración oral; la forma farmacéutica del producto corresponde a cápsula dura de gelatina, la cual está indicada en el tratamiento de infecciones del tracto urinario causados por gérmenes sensibles, complicadas o no complicadas, incluyendo cistitis u otros, causados por gérmenes susceptibles.

La técnica de análisis para la determinación cualitativa y cuantitativa de los principios activos que conforman la fórmula del medicamento no se encuentra descrita en obras oficiales: Farmacopea Americana, Farmacopea Británica, Farmacopea Japonesa, u otra; por lo cual se hace preciso desarrollar e implementar una técnica nueva de análisis para la identificación y cuantificación de dichos principios activos en una sola muestra.

De acuerdo a la exigencia y normatividad vigente referida a buenas prácticas de fabricación de productos farmacéuticos, se considera sumamente necesario que los procesos que participan en el ciclo productivo, incluyendo los métodos de análisis aplicados tanto para la evaluación de materias primas como para productos terminados, se encuentren validados; es por esto que en nuestro medio durante los últimos años, las empresas farmacéuticas, en cumplimiento de las exigencias de calidad, están orientando sus esfuerzos al desarrollo y ejecución de la validación de sus procesos.

II. OBJETIVOS

2.1. Objetivo General

Validar prospectivamente una nueva técnica analítica por Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC) para cuantificar Norfloxacino 500 mg y Fenazopiridina clorhidrato 50 mg en cápsulas de gelatina duras.

2.2. Objetivos Específicos

- Demostrar mediante la validación la confiabilidad, reproducibilidad y efectividad del nuevo método de análisis.

- Cumplir con las exigencias de calidad de acuerdo a las Buenas Prácticas de Manufactura de productos farmacéuticos, de acuerdo a lo establecido por la Dirección General de Medicamentos, Insumos y Drogas (DIGEMID).

III. GENERALIDADES

Cromatografía Líquida de Alta Performance - HPLC

3.2.1. Concepto

La cromatografía de líquidos de alta performance - HPLC (por sus siglas en inglés), es una técnica utilizada para la separación, identificación cualitativa y determinación cuantitativa de componentes químicos en mezclas complejas. (5)

Ampliamente utilizada en la industria farmacéutica por las ventajas que la técnica presenta, obteniendo un análisis cuantitativo rápido y preciso, es una operación automatizada, tiene una alta sensibilidad de detección pudiendo detectar nanogramos, picogramos, inclusive niveles de femtogramos; y una de las ventajas más importantes es la susceptibilidad a la detección de un 60% a 80% de todos los componentes existentes. Por otra parte, las limitaciones que presenta, son que el sistema no cuenta con un detector universal como en otros sistemas, por lo tanto la detección es problemática si el analito no absorbe haces de luz UV, otra desventaja se da cuando el analito no es fácilmente ionizado; y por último, la técnica por HPLC, tiene muchos parámetros operacionales que lo hace dificultoso para un principiante. (6)

Existiendo cuatro tipos principales de técnicas de HPLC que responden a las fuerzas moleculares básicas: fuerzas iónicas, fuerzas polares y fuerzas de dispersión; cada técnica específica a cada una de ellas: las fuerzas polares son el tipo dominante de las interacciones moleculares empleadas en HPLC de fase normal; las fuerzas de dispersión son empleados en HPLC de fase reversa; las fuerzas iónicas son empleados en HPLC de intercambio iónico; y el cuarto tipo de técnica de HPLC de exclusión de tamaño, se basa en la separación dinámica de las moléculas de acuerdo al tamaño que presente, sin la interacción del analito con la fase estacionaria. (7)

3.2.2. Partes

3.2.2.1. Fase estacionaria y fase móvil.

Siendo la cromatografía definida como un método físico de separación por la cual los componentes son separados y distribuidos en dos fases, una estacionaria y la otra móvil que se mueve en una determinada dirección. El sistema de HPLC presenta una gran versatilidad ya que abarca una serie de tipos de separación; teniendo cromatografía por adsorción donde el analito interactúa con una superficie sólida estacionaria y es desplazado por competencia con el eluente por los sitios activos de la superficie. La separación por partición cromatográfica resulta de una distribución termodinámica entre dos fases líquidas; mientras que la cromatografía por cambio iónico, está gobernada por la interacción entre los analitos ionizados y la carga opuesta de la superficie de la fase estacionaria. En la cromatografía por exclusión de tamaño, la fuerza de resistencia para la separación es el tamaño físico de los analitos, lo que determina su accesibilidad a los diferentes tamaños de poros en la superficie de la fase estacionaria. Los sistemas que constan de fases estacionarias polares y fases móviles no polares se describen como de fase normal, mientras que, por el contrario, cuando se emplean fases móviles polares y fases estacionarias no polares se denomina cromatografía en fase reversa. (8)

El diseño de las columnas para cromatografía de líquidos tiene un doble propósito, el primero separa los solutos individuales apartados por las diferentes fuerzas moleculares que se producen entre los solutos y las dos fases, en segundo lugar, limita la dispersión o difusión de cada banda de soluto a fin de ser separados uno de otro, que van eluyendo discretamente. Siendo esta la capacidad de la columna de contener la dispersión de pico que determina el diseño y las dimensiones de muchas partes del cromatografía.

Las columnas pueden estar divididas de acuerdo a la fase estacionaria o los materiales de apoyo; normalmente es una fase orgánica químicamente unida a sílice u otros materiales que se unen químicamente a un compuesto con un g3rupo funcional determinado. La unión más frecuente es la de silicagel por medio de una unión covalente, una de las mayores limitaciones es que por encima de pH 8-9 se disuelve y por debajo de pH 3 muchos compuestos se hidrolizan. El potencial de degradación incrementa también a elevadas temperaturas por encima de 60 – 70 °C; la silicagel es un sólido amorfo y poroso de gran área superficial (400 - 500 m2/g) siendo el diámetro de poro entre 80 a 300 Å. (8) (9) (10)

3.2.2.2. Bomba

El sistema de bombas puede ser considerado como el corazón del HPLC; las características de funcionamiento y rendimiento de la bomba fundamentalmente definen y limitan el tipo de separaciones que pueden ser realizadas; las características más importantes son: a) la reproducibilidad de caudal, b) el rango de caudal, c) la estabilidad de la presión. (9) (10)

Existen cuatro tipos de bombas: Las bombas de presión constante, las bombas de caudal constante, las bombas alternativas y las bombas de jeringa. (10)

3.2.2.3. Inyectores

La muestra a analizar debe ser introducida en la fase móvil; una válvula de inyección adecuadamente diseñada y utilizada de manera correcta, asegura máxima eficiencia durante la cromatografía. Hoy en día la inyección manual es poco frecuente y sólo es justificado cuando la cantidad de muestra es limitada; la utilización de inyectores automáticos facilita la transferencia de muestras y el procesamiento automático de variables operativas como el control de volumen, número de inyecciones, el intervalo entre las inyecciones, ciclos de enjuague de las muestras; suprimiendo factor del error humano y mejorando la precisión del método. (9)

3.2.2.4. Detectores

El propósito de un detector en un sistema de HPLC es identificar la presencia de componentes de interés del eluente proveniente de la columna del HPLC. El analito es reconocido por interacciones fisicoquímicas como por ejemplo la de absorbancia de radiación UV en una cierta longitud de onda.

Los detectores pueden ser clasificados dentro de dos categorías; los detectores basados en una propiedad de disolución que responden cualquier cambio de la alguna propiedad física de la fase móvil, tal como el índice de refracción, la constante dieléctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por contraste, los detectores basados en una propiedad del soluto responden únicamente a propiedades del analito, como la absorbancia UV, fluorescencia, o actividad electroquímica, que no son propias de la fase móvil.

Para la investigación de desarrollo de técnicas analíticas, existen siete especificaciones que son importantes: La linealidad, rango dinámico lineal, nivel de ruido, sensibilidad o concentración mínima detectable, sensibilidad a la presión, sensibilidad de flujo, sensibilidad de temperatura. (6) (9) (10)

3.2.2.5. Sistemas de toma y procesamiento de dato

Para toma de datos, procesamiento de datos y el reporte, el uso de un sistema informático integrado es esencial. Este sistema integrado, recibe y almacena la señal de los detectores e imprime cromatogramas completos, e incluso controla la mayoría de variables operativas como selección de muestras, válvulas de muestreo, condiciones del detector, entre otros; simplificando el trabajo tedioso de una selección manual de las condiciones operativas cromatográficas; con el objetivo de obtener el cromatograma con fracciones separadas e identificadas de cuya interpretación

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