Cromatografía liquida en columna clásica

Cromatografía II

Cromatografía liquida en columna clásica

Esta cromatografía utiliza una columna para separar los distintos componentes, la principal diferencia que tiene con la cromatografía plana, básicamente, la cromatografía plana si bien está dentro de un recipiente hermético y está cubierta, la cromatografía en columna no, cromatografía en columna es cerrada y es ahí por donde van pasando los analitos.

Columnas

• Principalmente de vidrio, cilíndricas, pero también pueden ser de plástico y metálicas.
• 10 cm – 1 m de largo (hoy son de 20 a 30 cm), 1-5 cm de ancho
• En la parte inferior tienen una llave que permite el escurrimiento de FM
• En la parte superior son abiertas o cerradas mediante bombas
• Soportan bajas presiones

Antiguamente la cromatografía se hacía en laboratorios, actualmente no se utiliza mucho. [pic 1]

•  Es una cromatografía solida porque la fase móvil es líquida y la vamos haciendo pasar por esta probeta que dentro contiene distintos tipos de sólidos, como la albumina que va a hacer de fase estacionaria.

[pic 2]

La manera de ir cuantificando (más rudimentario) es ir recibiendo en tubos de ensayo los componentes a medida que se vayan diferenciando, en este caso se podría diferenciar por colores por lo que podemos saber cuándo tenemos un analito y cuando se liberara el otro, pero si eventualmente no supiéramos cual analito es cual, porque no estuviesen coloreados, se tendrían que diferenciar de alguna otra manera en el momento de la detección. Si nos fijamos en el grafico nos podemos dar cuenta que es discontinuo, lo cual quiere decir que a la separación no le sigue inmediatamente la detección, hay que sacarlos en un tubo de ensayo e ir a analizarlos a la metodología detección escogida, en este caso lo hacen con longitudes de onda, es decir un método espectrofotométrico (métodos bastante antiguos).  

Como dije la clase pasada, la cromatografía era una técnica de separación y luego se le fueron agregando los distintos detectores para instrumentalizarla aún más.

Resumiendo, un poco, al igual que la cromatografía instrumental, necesitamos:

1. Introducción de la muestra

• Sobre la cabeza de la columna con pipeta o micropipeta

1. Separación o desarrollo de los analitos
2. Detección (depende de la tecnología que se utiliza)

• Continua: se conecta un detector a la salida de la columna
• Discontinua: se recibe el eluyente a la salida de la columna recogiéndolo en fracciones de volumen determinado, a las cuales se les practica reacciones cualitativas para identificar el analito.

1. Tratamiento de los datos

Cualitativos:

- Relativo: basado en el tR del analito comparado con estándares

- Absoluto: se aplica espectroscopia IR (técnica que sirve más para identificar) o masa.

Cromatografía liquida de alta eficacia (es más instrumental)

La principal diferencia entre la cromatografía clásica y la instrumental. es el tipo de columna esto irá de la mano con el parámetro (altura de los valores teóricos) que tiene que ver con el tamaño de las partículas que componen la columna en el interior. Si tenemos columnas compuesta con partículas más pequeñitas, el analito cuando vaya pasando por esta columna se va a ir separando con una mejor resolución que el analito continuo.

¿Qué mecanismo de separación predomina? 🡪  tenemos por polaridad (adsorción, fase estacionaria solida), por tamaño (exclusión (cromatografía de columna clásica, básicamente por el tamaño de partículas)), por carga iónica (intercambio iónico) y cuando es una fase estacionaria liquida (partición, que tiene que ver con la solubilidad). Aquí predomina la adsorción, por polaridad.

[pic 3]

Filtración

Es sumamente importante la filtración y se realiza este proceso para proteger al instrumento y la columna, tanto las muestras, los estándares y las fases móviles deben estar completamente filtradas, y la fase móvil en particular debe estar libre de burbujas (se utiliza el zonificado para desgasificar soluciones para eliminar burbujas de la solución).  

¿Por qué no puede haber gas ni partículas sólidas en la fase móvil? 🡪 porque puede existir un colapso en las válvulas, y esto puede ocurrir en las columnas o puede ocurrir con los viales que conectan todos los instrumentos donde pasa la fase móvil.

• Tanto las muestras como los estándares y la FM deben estar totalmente libres de partículas en suspensión.
• Las partículas presentes en las muestras pueden rayar los sellos del inyector o bloquear algún componente del sistema cromatográfico especialmente tuberías o filtros de columnas.
• La filtración se realiza en filtros de membrana de 0.45 o 0.22 micras de material apropiado.

Característica que debe tener la muestra para análisis por HPLC

• Solución libre de partículas
• Solvente miscible con la FM 🡪 SUPER IMPORTANTE, para que no exista un tiempo muerto.
• Solubilidad del soluto en la FM, especialmente en gradientes de composición
• Compatibilidad del solvente de la muestra con el detector y la FE

Etapas en el proceso

1. Introducción de la muestra

Mediante válvulas de inyección:

• La muestra disuelta en un solvente adecuado se introduce en las válvulas, luego esta se gira, se mueve la FM y se produce el paso de la muestra a la columna.
• El inyector es el dispositivo que permite introducir la muestra en Solución sin interrumpir el caudal de solvente a través del sistema.
• Características del inyector: fácil de operar, inerte al ataque químico y capaz de soportar altas presiones, preciso en cuanto a la capacidad de muestra introducida al sistema, no debe provocar diluciones.
• Loop: Tubos de acero inoxidable de volumen exacto, conectados a la entrada de la muestra. Se debe inyectar volumen mayor que volumen máximo del Loop para asegurar que se llene completamente y el exceso se elimina por drenaje.

*Pregunta certamen: ¿de qué dependía el volumen de inyección? 🡪 del tamaño del loop, el loop vendría siendo el compartimento en donde se almacena la muestra previamente al sistema cromatográfico, entonces el loop hace de reservorio de muestra que hace de 20-25 mcl. Siempre se debe ingresar más volumen de lo que se queda en el loop, si ingresamos lo justo o menos de lo indicado, quedara un espacio con aire y esto podría hacer que colapse las columnas.

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