Cromatografía En Columna

Cromatografia en columna

Es una técnica de purificación, puesto que permite aislar los compuestos deseados de una mezcla.

Procedimiento

La cromatografía en columna utiliza una columna de vidrio vertical que se llena con un soporte sólido adsorbente (fase estacionaria: los más utilizados son gel de sílice (SiO2) y alúmina (Al2O3)) . La muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de este soporte. El resto de la columna se llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase móvil) que, por efecto de la gravedad, hace mover la muestra a través de la columna. Se establece un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente eluyente que fluye por la columna. Debido a que cada uno de los componentes de una mezcla establecerá interacciones diferentes con la fase estacionaria y la móvil, serán transportados a diferentes velocidades y se conseguirá su separación. Así, de manera similar a otros tipos de cromatografía, las diferencias en las velocidades de desplazamiento a través del medio sólido se corresponden con diferencias en los tiempos de elución por la parte inferior de la columna para cada uno de los componentes de la muestra original, que se recogerán en fracciones diferentes.

La polaridad del eluyente afecta las velocidades relativas con las que los diferentes componentes de la mezcla se mueven en la columna. Los disolventes polares compiten más eficientemente con las moléculas polares de una mezcla por los lugares polares del adsorbente. Por lo tanto, un disolvente polar desplazará las moléculas, incluyendo las más polares, rápidamente a través de la columna. Si el disolvente es muy polar la elución será muy rápida y generalmente habrá poca separación de los componentes de la mezcla. Si por el contrario el disolvente es muy apolar, no eluirán los compuestos de la columna. Por lo tanto, la elección del eluyente es crucial para el éxito de la cromatografía en columna. A menudo se utiliza un gradiente creciente de polaridad para la elución. La CCF se utiliza para determinar y elegir el sistema solvente adecuado para cada separación.

En 1978 se introdujo una versión modificada denominada cromatografía en columna rápida. La diferencia con la cromatografía en columna tradicional es que en la técnica rápida el disolvente se hace atravesar la fase estacionaria aplicando una presión positiva. Esto hace que las separaciones mejoren en resolución y se pueda disminuir el tiempo de elución, por lo cual constituye un método de elección.

Análisis de los eluatos de la columna

Si los compuestos separados en una cromatografía en columna son coloreados, el progreso de la separación se puede monitorizar visualmente. No obstante, a menudo los compuestos que deben ser aislados suelen ser incoloros. En este caso, se recogen secuencialmente pequeñas fracciones de eluatos en tubos rotulados y la composición de cada fracción se analiza por cromatografía en capa fina. Una vez identificadas las diferentes fracciones que contienen el mismo producto, se reúnen, se elimina el disolvente y se analiza la identidad de los componentes por métodos espectroscópicos.

http://www.ub.edu/oblq/oblq%20castellano/cromatografia_tipus.html#

Cromatografía de Capa Fina en la Purificación de los Lípidos

Dr. Gary Witman, Dr. Mark Moskovitz

La purificación de los lípidos se ha convertido simple y conveniente. Hace unos veinte años HPLC remplazo cromatografía de gases preparativa como el método de elección para el análisis de los lípidos. Pero en estos días, preparación comercial de placas de TLC con revestimiento previo hacen precisamente un trabajo tan bueno como HPLC y son mucho más cómodo de utilizar. Además, cromatografía en capa fina es francamente una herramienta barata de análisis, una característica con gran mérito en tiempos de restricciones presupuestarias. Placas de TLC de alto rendimiento fabricado con gel de sílice o alúmina preparada con uniforme de material de pequeño tamaño de las partículas para la fase estacionaria permite separaciones con excelentes tiempos de elución corto. Como se explica más adelante, en el análisis de los lípidos complejos por TLC es simplemente una cuestión de usar reactivos específicos de pulverización para detectar determinados grupos funcionales de los lípidos: la sencillez en el rendimiento no es posible con HPLC. TLC es increíblemente flexible, dado que se puede utilizar en la adsorción, complejación fase reversa o modos, como por ejemplo la separación de los componentes lipídicos complejos integrados en las membranas de células de mamíferos o en los aceites vegetales. Al realizar un análisis cuantitativo de estas separaciones de lípidos se recomienda que el espesor de el absorbente colocada sobre la placa preparada sea mayor que para el análisis cualitativo.

No hay tecnología de costo más bajo y de alta resolución disponible para la detección de los lípidos. De hecho, hay informes de que algunos investigadores sustituyan institucional frascos de mayonesa tamaño de las cámaras de TLC que luego son cubiertos por una placa de vidrio plano en el que realizan experimentos. Qué manera de ser capaz de mantener los costes de investigación abajo! Placas de TLC estándares son de 20 cm de altura, con anchos variables. El ancho de una carta con platos de TLC depende del número de muestras que sean cromatografados. Recomendamos el uso de un tamaño estándar preparados comercialmente de placa de TLC, que es de 20 x 20 cm.

Cromatografía en capa fina (TLC) se utiliza actualmente para dos diferentes métodos de análisis de lípidos. En el primer enfoque, las diferentes clases de lípidos están separadamente extraídos y luego cada clase de lípidos se analiza a través de la metodología única de TLC. En el segundo enfoque, mezclas complejas de los lípidos se separan en las placas de TLC y, a continuación se caracteriza más. Las clases de lípidos se dividen en lípidos neutros como los triglicéridos (forma que se forma una molécula de glicerol y tres ácidos grasos), los lípidos polares como los fosfolípidos y colesterol. Idealmente, los lípidos son depositadas en una sola de alúmina o de gel de sílice de placa de TLC con sistemas de solventes secuencial corriendo en la misma dimensión. Relativamente lípidos no polares como lípidos neutros, ácidos grasos y colesterol migran a posiciones únicas en la mitad superior del cromatograma, mientras que los lípidos relativamente polares como los fosfolípidos y esfingolípidos están separados en la mitad inferior del cromatograma.

En el modo de adsorción (gel de sílice o alúmina es un agente absorbente excelente) una aplicación principal es para la separación de clases de lípidos diferente de tejidos animales

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