Bacteriologia

INFORME DE LABORATORIO.

PRACTICA #1: COLORACIONES MÁS FRECUENTES EN BACTERIOLOGÍA

NUBIS MENCO MORALES

Bacterióloga.

UNIVERSIDAD DE CORDOBA

FACULTAD: CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA: BACTERIOLOGIA

MONTERIA-CORDOBA

FEBRERO 2013

INTRODUCCIÓN

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico, además de esto resultan ser transparentes. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante.

En la presente práctica de laboratorio se expondrán los procedimientos utilizados para realizar las coloraciones, en este caso optamos por elegir la coloración de Gram ya que es una de las más importantes en el campo de la Bacteriología y con que tendremos más contacto en nuestra formación y vida profesional.

OBJETIVOS

• Conocer a fondo el fundamento de las coloraciones más utilizada en Bacteriología debido a que las coloraciones facilitan mucho la observación de las estructuras bacterianas.

• Adquirir destreza y nuevos conocimientos en el proceso relacionado con las coloraciones.

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MATERIALES DE LABORATORIO

• Muestras clínicas (esputo, secreciones faríngeas, óticas, de heridas, bronquiales, nasales, bucales, orina)

• Coloración de Gram

• Coloración de Ziehl Neelsen

• Tinta china

• Portaobjetos

• Asas

• Mechero

• Cronometro

• Frasco lavador

• Cubeta de tinción

• Malla de asbesto

• Encendedor

PROCEDIMIENTO

El procedimiento que empleamos para realizar la coloración de Gram es el siguiente:

1. Colocamos sobre un portaobjetos limpio y desengrasado una gota de agua destilada y una pequeña porción del cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril.

2. Preparamos un extendido fino de Staphylococcus aureus y E. coli y lo dejamos secar al aire.

3. Fijamos el extendido con el fin de que no sea arrastrado durante el proceso de tinción, pasamos el portaobjetos 3 veces por la llama del mechero de Bunsen.

4. Colocamos el preparado sobre un soporte de tinción y cubrimos la superficie con solución cristal violeta por un (1) minuto.

5. Después que paso el minuto, lavamos con agua destilada.

6. Seguidamente cubrimos el preparado con lugol Gram por un (1) minuto. Lavamos nuevamente con agua destilada.

7. Sostuvimos el portaobjeto y bañamos la superficie con gotas del decolorante alcohol acetona. Lo dejamos actuar 10 segundos.

8. Lavamos con agua destilada y colocamos nuevamente el portaobjeto sobre el soporte. Cubrimos la superficie con Safranina, dejamos actuar por un (1) minuto. Lavamos con agua.

9. Luego de esto escurrimos el exceso de agua y dejamos que se secara el extendido

10. Examinamos el extendido al microscopio con objetivo de inmersión (100x).

POST- LABORATORIO

• Mediante un dibujo indique las diferencias entre la pared celular de las bacterias Gram positivas y las Gram negativas. Ver pag siguiente.

 Que son coloraciones positivas y coloraciones negativas?

Coloraciones Positivas: La coloración positiva es la tinción de los microorganismos, efectuada con colorantes básicos que, como ya dijimos, poseen afinidad por los constituyentes celulares y se combinan químicamente con el citoplasma microbiano.

Técnica: Se cubre el frotis, después de fijado, con la solución colorante y se deja actuar el tiempo preciso. Luego se lava con agua y se deja secar.

• Con fucsina básica: se diluye 1/10 la solución de uso (fucsina fenicada de Ziehl) y se deja actuar 30 a 60 segundos.

• Con violeta de genciana: se diluye al 1/10 la solución de uso y se deja actuar 30 a 60segundos.

• Con azul de metileno: se cubre el preparado con la solución de uso (azul de metileno alcalino de Loeffler) sin diluir y se deja actuar 3 a 5 minutos.

El azul de metileno es el colorante más débil de los tres, razón por la cual se

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