TÉCNICAS EN BIOTECNOLOGÍA. PRÁCTICA 1-2.

TÉCNICAS EN BIOTECNOLOGÍA. PRÁCTICA 1-2

ACTIVIDAD CITOTÓXICA

Dina Ariza-Pérez1, Katleen Martínez-Villa1, Zaira Mejía-Salazar1 & Óscar Núñez-

Velandia1.

1Estudiantes de Biología. Facultad de Ciencias básicas. Universidad del Atlántico, Km 7 Antigua vía Puerto colombia. Atlántico, Colombia. dina_saray22@hotmail.com (D. A.), kathleenkud@hotmail.com (K. M.), zairamejia_95@hotmail.com (Z. M.) & oscarnn3011@gmail.com (O. N.)

RESUMEN

Se evaluó la viabilidad de la línea celular SF21 de Spodoptera frugiperda mediante el bioensayo con azul de tripano como indicador de células viables (no teñidas) y células no viables (teñidas), obteniendo un porcentaje de viabilidad del 6,06 % y una concentración de 2 * 104 células/ml lo que no representa un resultado significativo a la hora de evaluar algún tipo de actividad celular, como la citotoxicidad. La poca viabilidad celular en este caso pudo haber ocurrido por factores como el inadecuado tratamiento de la muestra a la hora de su preparación para realizar el conteo.

Palabras clave: viabilidad, azul de tripano, línea celular SF21, Spodoptera frugiperda.

ABSTRACT

the viability of SF21 cell line Spodoptera frugiperda was assessed by trypan blue bioassay as an indicator of viable cells (unstained) and non-viable cells (stained), obtaining a percentage viability of 6.06% and a concentration of 2 * 104 cells / ml which does not represent a significant result when evaluating any type of cell activity such as cytotoxicity. The low cell viability in this case could have occurred by factors such as inadequate treatment of the sample at the time of its preparation for the count.

Keywords: viability, trypan blue, cell line SF21, Spodoptera frugiperda.

INTRODUCCIÓN

En muchos laboratorios de investigación comúnmente se diseñan métodos para aislar y preparar los diversos tipos de células según la necesidad de la investigación, una de las primeras consideraciones que se requiere evaluar al utilizar estos métodos de separación es la “viabilidad” de las células aisladas, para establecer que se encuentren en buen estado dentro de los procesos de experimentación. La viabilidad es definida por Warters Hofer (1974) como la capacidad de demostrar que la célula posee una membrana funcional e íntegra y con actividad metabólica activa. Hay diferentes formas de estudiar la viabilidad de las células, desde pruebas sencillas en las que se utilizan colorantes hasta las más complejas donde se emplean sustancias radioactivas (Martínez 2002). Los métodos de tinción celular se emplean como aproximación indirecta para la masa celular viable (Escobar et al. 2009). Uno de los métodos particularmente simples es la prueba de viabilidad con azul de tripano, éste es un colorante derivado de la toluidina que posee la capacidad de teñir tejidos y células muertas. Este colorante es uno de los empleados para evaluar la viabilidad de las células por exclusión de captación, ya que no puede penetrar y teñir a las células vivas con membranas íntegras. El azul de tripano no es necesario para realizar conteo simple de células, pero sí es imprescindible para diferenciar entre células muertas (con disrupción membranal) de las vivas con membranas íntegras (UASLP 2011). Una de las grandes ventajas de este método es que se pueden detectar sustancias tóxicas en concentraciones muy pequeñas. Esta práctica se realizará con el fin de determinar el porcentaje de viabilidad celular inicial de células de Spodoptera frugiperda de la línea celular SF21 mediante el método de azul de tripano.

MATERIALES Y MÉTODOS

• Cultivo de línea SF21 celular de insecto (Spodoptera frugiperda).
• Azul de tripano 1%.
• Tubos Eppendorf.
• Cámara de neubauer.
• Microscopio óptico.
• Micropipeta.
• Cubreobjetos.

A partir de un cultivo de la línea celular SF21 de insecto (Spodoptera frugiperda) enriquecido con suero con 10% de suero bovino en un medio TNM-FH y antibiótico 1% incubado durante 48 horas, se realizó un análisis de viabilidad celular, usando azul de tripano como indicador.

Las células, fueron resuspendidas mediante la inclinación del frasco, tomando el líquido del medio y dejándolo caer en el fondo del frasco inclinado, esto con el fin de obtener las células que se encontraban adheridas al fondo. La recolección de las células se realizó tomando 50 μL del medio y depositándolo en un tubo Eppendorf. Posteriormente fueron adicionados 25 μL de azul de tripano y la nueva solución fue depositada en una cámara de neubauer, para realizar el conteo de células viables (no teñidas) y no viables (teñidas) en el microscopio óptico. Finalmente, se obtuvo el porcentaje total de viables y no viables como el número de células vivas totales dividido entre el número de células totales × 100 y además se encontró la concentración de las células expresada en términos de células por ml de solución.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Luego de descongelar la línea celular SF21 de Spodoptera frugiperda y de la adición del azul de Tripano para observar las células teñidas (no viables) y las no teñidas (viables), se observó el número de células viables y no viables en la cámara de Neubauer con un microscopio óptico. Luego de cuatro repeticiones se obtuvo un total de 31 células no viables y 2 células viables (Tabla 1). Con este resultado se obtuvo el porcentaje de viabilidad inicial.

Tabla 1. Conteo de células viables y no viables en cuatro repeticiones en una cámara de Neubauer.

El porcentaje de viabilidad fue de 6,060606061%, de acuerdo a este resultado el experimento con la línea celular SF21 no es válido, puesto que el valor obtenido fue menor al 85% de viabilidad.

Luego de encontrar el porcentaje de viabilidad inicial se obtuvo la concentración de células en ml de solución:

Ecuación 1. Concentración de células por volumen de solución.

2 células * 104  = 2 * 104 células/ml.

Estos resultados contrastan con los obtenidas en prácticas similares, donde la concentración celular de viables suele ser elevada respecto a las no viables, lo que puede deberse a errores en la realización del cultivo celular o a una inadecuada resuspensión de la muestra. También es posible que se deba a la poca exactitud de los volúmenes tomados con las micropipetas o el inadecuado conteo de las células bajo el microscopio. En otras condiciones es de esperar encontrar un número significativo de células viables que permitan llevar a cabo el desarrollo de un estudio en el que se requiera determinar algún tipo de actividad celular.

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