MÉTODOS Y TÉCNICAS DE LABORATORIO UTILIZADAS EN EL DIAGNÓSTICO DE SARS-CoV -2 CAUSANTE DEL COVID -19

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FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE

MEDICINA HUMANA|

MONOGRAFÍA

“MÉTODOS Y TÉCNICAS DE LABORATORIO UTILIZADAS EN EL DIAGNÓSTICO DE SARS-CoV -2 CAUSANTE DEL COVID -19”.

Autor:

Muñoz Cieza Harold Angel

Docente:

MD. Villegas Chiroque, Miguel

MD. Rodríguez Llanos, Juan

Línea de Investigación:

Ciencias de la vida y cuidado de la salud humana

Pimentel – Perú

2021- II

1. INTRODUCCIÓN

La enfermedad por COVID-19, declarada como pandemia el 20 de enero del 2021 por la OMS, es causado por el virus perteneciente a la familia coronaviridae responsable del síndrome respiratorio agudo severo tipo-2 (SARS-CoV-2), esta cepa mutante y contagiosa se transmite rápidamente de persona a persona a través de la tos o secreciones respiratorias, y por contactos cercanos; las manos o los fómites contaminados con estás secreciones seguido del contacto con la mucosa de la boca, nariz u ojos. En la gran mayoría de personas la infección por SARS-CoV-2 presenta síntomas tales como la tos, fiebre, escalofríos, dolor de garganta, artralgia, cansancio, disnea, malestar general, cefalea y dolor de pecho, pero en los pacientes con edad avanzada donde la enfermedad puede progresar hasta una forma grave de neumonía intersticial, que rápidamente evoluciona y causa la muerte a entre el 2 % y el 5 % de los casos, aunque factores como la edad y las enfermedades crónicas preexistentes pueden incrementar esta cifra. El alarmante y constante crecimiento de esta pandemia hace imprescindible conocer e implementar métodos de diagnóstico confiables para la detección viral oportuna y el tratamiento adecuado de los pacientes, contribuyendo a frenar la propagación de la enfermedad. Estudios como los realizados por Diao B y su equipo (2020) se informó que un ensayo inmunocromatográfico de fluorescencia es un método preciso, rápido, temprano y simple para detectar, en un hisopado nasofaríngeo y orina, la proteína nucleocápside del SARS-CoV-2 para el diagnóstico de COVID-19. En una investigación realizada por Ai T y colaboradores (2020) donde se comparó la eficacia de la RT-PCR en China, se incluyeron un total de 1,014 pacientes y reportaron una sensibilidad del 97%, especificidad del 25%, un valor predictivo positivo del 65% y un valor predictivo negativo del 83%.9, sin embargo, esto depende del sitio de toma de la muestra, ya que la sensibilidad del lavado bronquioalveolar es del 93%, del aspirado bronquial o esputo es del 72% y de hisopado tanto nasal como faríngeo es del 63%. Si bien el procedimiento de elección es la PCR, también es necesario disponer de otras pruebas tanto cualitativas, cuantitativas, así como las rápidas simples e idealmente con alta sensibilidad y precisión y que se puedan realizarse a gran escala. Por todo lo mencionado el presente trabajo tiene como finalidad el poder dar a conocer las diferentes alternativas de detección del SARS-CoV-2, ya que un diagnostico diagnóstico precoz, permite un mejor manejo (aislamiento y tratamiento si es necesario), monitorización de los pacientes y la aplicación de medidas de prevención y control de la expansión, así como de la vigilancia epidemiológica de la Covid-19.

1. OBJETIVOS

1. Conocer las fases del proceso de diagnóstico de laboratorio del SARS CoV-2, causante de la COVID – 19.
2. Conocer los diferentes tipos de muestras utilizadas en el análisis y diagnóstico SARS CoV-2, causante de la COVID – 19.
3. Conocer los métodos y técnicas empleados para el diagnóstico del SARS CoV-2, causante de la COVID – 19.
4. Conocer en que etapas del proceso de enfermedad del COVID 19, se deberían aplicar las diferentes técnicas de diagnóstico de laboratorio.

1. MARCO TEÓRICO

1. DEFINICIÓN DE TÉRMINOS

COVID-19: Nombre dado a la enfermedad respiratoria causada por el SARS-CoV-2. Esto significa enfermedad del coronavirus 2019.

SARS-CoV-2: Nombre oficial del coronavirus que se ha descubierto recientemente, que significa Coronavirus Síndrome Respiratorio Agudo Severo 2. Esto significa Coronavirus Síndrome Respiratorio Agudo Severo 2.

Técnica de Laboratorio: Conjunto de procedimientos y  protocolos que se aplican para el proceso de análisis y/o estudio de una determinada muestra y  tiene como objetivo obtener un resultado y que requiere tanto destrezas manuales como intelectuales y el uso frecuentemente  de herramientas y de varios conocimientos.

Antígeno SARS-CoV-2: Sustancia que puede ser reconocida por los receptores del sistema inmunitario adaptativo. Para el caso del SARS-CoV-2, constituyen las proteínas que forman la parte de la estructura del Virus.

RT-PCR: Variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ácido desoxirribonucleico (ADN).

Anticuerpo: Proteínas que forman parte del sistema inmune y circulan por la sangre. Cuando reconocen sustancias extrañas para el organismo, como los virus y las bacterias o sus toxinas, las neutralizan. Una vez el cuerpo se ha expuesto a una sustancia (antígeno), los anticuerpos producidos para atacarlo persisten en la sangre, ofreciendo protección en el caso que, en un futuro, volvamos a contactar con el mismo antígeno.

1. ANTECEDENTES

• Liu et al. analizaron, por medio de RT-PCR, la expresión génica de los fragmentos del SARS-CoV-2 a partir de muestras de esputo, lavado broncoalveolar e hisopado del tracto respiratorio provenientes de 4880 pacientes con síntomas de infección respiratoria o contacto cercano con el virus en el hospital de Wuhan. Se realizó el secuenciamiento del fragmento génico ORF1ab y de un fragmento de la proteína de la nucleocápside (NP). Para un diagnostico confirmatorio, los autores consideraron como pacientes SARS-CoV positivos a los que presentaron ambos fragmentos génicos. Para el esputo, el fragmento NP fue expresado en el 49,12 % de pacientes mientras que el fragmento ORF1ab en el 50,88 %, y el porcentaje de pacientes que expresaron ambos fragmentos fue del 49,12 %. En el lavado broncoalveolar, el fragmento NP fue expresado en el 80 % de pacientes, mientras que el fragmento ORF1ab en el 100 %, y el porcentaje de pacientes que expresaron ambos fragmentos fue del 80 %. En el caso del hisopado del tracto respiratorio, el fragmento NP fue expresado en el 39,8 % de pacientes, mientras que el fragmento ORF1ab en el 40,98 %, y el 38,42 % de los pacientes expresaron ambos fragmentos. De estos resultados, encontraron que los pacientes más expuestos son los adultos mayores de 70 años con el 61,81 % de incidencia. Por otro lado, un grupo de pacientes tuvieron alguna sintomatología asociada al coronavirus, pero fueron descartados ya que su resultado salió negativo, lo que mostró la eficacia de esta técnica en la identificación del SARS-CoV-2.
• Corman et al. propusieron una prueba diagnóstica que discrimina 2019-nCoV de SARS-CoV, mediante el secuenciamiento de 297 muestras clínicas que contienen todo el espectro de virus respiratorios humanos. Para esto se diseñaron cebadores para el secuenciamiento génico de los siguientes fragmentos: 1) ORF1ab-gen RdRp en la posición 15361-15460 nts; 2) gen de la proteína E, posición 26141-26253 nts, y 3) gen de la proteína N posición 28555-28682 nts. Los cebadores fueron diseñados en base al secuenciamiento de la primera muestra obtenida en la provincia de Wuhan en diciembre de 2019 (NM908947 Wuhan-Hu-1) y de otras muestras virales (NC-004718 SARS-CoV). Se demostró que estos cebadores diseñados se acoplan a varias especies SARS-CoV, lo que indica que todas las muestras SARS son Betacoronavirus. Por otro lado, decidieron alinear las secuencias génicas de todas las muestras analizadas: 1) las muestras de la ciudad de Wuhan nombrada como BetaCoV/Wuhan/PBCAMS-WH-01/2019/EPI_ISL_402123; 2) Bat SARS CoV (murciélago) nombrado para el ensayo como bat-SL-CoVZC45 (número de acceso GenBank MG772933), así como 3) el miembro más distante dentro del CoV de murciélago relacionado con el SARS detectado en Bulgaria, el Bat coronavirus BM48-31/BGR/2008 (número de acceso de GenBank NC_014470). No se encontraron diferencias en la secuencia nucleotídica para la proteína E, pero sí en los genes RdRp y N, lo que muestra que existen diferencias en la secuencia nucleotídica en los virus SARS, lo que sirve como una prueba de diferenciación de una especie viral frente a otra.
• Guo et al24 (2020) analizaron con métodos de inmunoanálisis (ELISA) 208 muestras de plasma de 82 casos confirmados por PCR y 58 casos probables. A día +1 del inicio de síntomas ya se detectaron anticuerpos en algunos pacientes. Sin embargo, en 18 de los 82 casos (22%) confirmados por PCR no se detectó IgM. De esos 18 pacientes 13 fueron analizados en los 7 primeros días del comienzo de la clínica por lo que quizás estos pacientes aún no habían desarrollado títulos detectables de IgM. El método de análisis no presentó reacción cruzada entre SARS-CoV-2 y otros coronavirus humanos. Además, se estudió una familia con 2 casos y 4 contactos estrechos y se comprobó la utilidad de los anticuerpos en el diagnóstico cuando la clínica es sugerente, pero PCR negativa y la existencia de anticuerpos anti-SARS-CoV-2 en pacientes asintomáticos.
• Zhao et al (2020) analizaron también los niveles de anticuerpos por ELISA en 173 pacientes. A los 7 días de iniciar la clínica sólo el 38.3% dieron positivo, elevándose al 89.3% en la segunda semana.
• Li et al (2020) comparó niveles de anticuerpos de muestras de sangre capilar con muestras de plasma y suero de sangre venosa y no detectaron diferencias en los resultados para 7 casos positivos y 3 casos control negativos.

3.3. FUNDAMENTACIÓN DEL SUB TEMA

AGENTE ETIOLÓGICO

El virus del síndrome respiratorio agudo severo tipo-2 (SARS-CoV-2), causante de COVID-19, se ubica taxonómicamente en la familia Coronaviridae. Esta familia se subdivide en cuatro géneros: Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus y Deltacoronavirus. Muchos coronavirus de los cuatro géneros mencionados son causantes de enfermedades en animales domésticos, y por lo tanto son principalmente de interés veterinario. Los coronavirus de importancia médica conocidos hasta hoy son siete, y pertenecen a uno de los dos primeros géneros mencionados. Desde el punto de vista ecoepidemiológico se pueden clasificar en dos grupos: coronavirus adquiridos en la comunidad (o coronavirus humanos, HCoV) y coronavirus zoonóticos. Los coronavirus humanos circulan libremente en la población de todos los continentes, suelen causar enfermedad respiratoria leve. Se estima que producen entre el 10% y el 30% de los casos de resfriado común. Por el contrario, los coronavirus zoonóticos circulan transitoriamente, pero pueden generar grandes epidemias de enfermedad respiratoria grave. Los coronavirus humanos circulan libremente en la población de todos los continentes, suelen causar enfermedad respiratoria leve. Se estima que producen entre el 10% y el 30% de los casos de resfriado común. Por el contrario, los coronavirus zoonóticos circulan transitoriamente, pero pueden generar grandes epidemias de enfermedad respiratoria grave.

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