Preinforme Catecolasa

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502507

GUíA No 4- FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS CATECOLASA o POLIFENOLOXIDASA

I. EL PROBLEMA

Verificar in vitro los factores físicos y químicos que afectan la actividad de las enzimas

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Algo específico de la célula es su capacidad para llevar a cabo reacciones químicas rápidas a temperatura ambiente, esto es posible porque ellas se realizan debido a la participación de las enzimas, las cuales coadyuvan a la transformación de sustratos en productos. Las características principales de estas moléculas nitrogenadas es que son: a) proteínas (excepción las ribozimas); b) catalizadores y c) específicas.

Con base en estas propiedades se puede concluir que una enzima es una proteína sintetizada por la célula que cataliza o acelera una reacción termodinámicamente posible y de manera muy específica.

La sustancia sobre la cual actúa la enzima se llama sustrato, el cual se une al catalizador por medio de los aminoácidos del sitio activo que éste presenta en su estructura tridimensional, formando lo que se denomina complejo enzima-sustrato; al llevarse a cabo la reacción se obtiene el o los productos y se libera la enzima sin modificarse ni tampoco alterar en ningún momento la composición química del sustrato ni la de los productos.

Algunas enzimas son poco activas sin la presencia de un cofactor el cual es generalmente inorgánico, un ión metálico que frecuentemente es el responsable de la actividad catalítica, si por alguna razón no existe, la enzima no funciona. Se denomina activadores a los iones metálicos que hacen parte de la estructura de las mismas como ejemplos se puede citar: el Fe2+, Mg2+, Cu2+ , Zn2+, K+ y Na+, entre otros.

Otros cofactores son orgánicos y se llaman coenzimas generalmente compuestos orgánicos de bajo peso molecular es también algunas veces necesaria para la actividad óptima de los catalizadores biológicos. Las vitaminas hidrosolubles (tiamina B1, riboflavina B2, niacina B3, piridoxal B6, etc.) y los nucleótidos de adenina, son moléculas representativas que actúan como coenzimas. Tales colaboradores de la actividad enzimática, se les puede denominar grupos prostéticos por su unión fuerte. A la unión entre la enzima y el cofactor se le nombra como holoenzima y se llama apoenzima a la enzima sin actividad biológica.

La actividad de una enzima depende fundamentalmente de agentes físicos y químicos tales como:

a).Concentración del sustrato b). Concentración de la enzima

c). Presencia de activadores d). Presencia de inhibidores

e). El pH. f). La temperatura.

En la práctica se confirmará experimentalmente algunos de los factores arriba relacionados, utilizando la polifenol oxidasa o catecolasa la cual pertenece al grupo de las oxidorreductasas.

La enzima catecolasa contiene ión cobre como parte de su estructura. La feniltiourea combinada con la porción de cobre que contiene el enzima impide el acoplamiento de ésta con el catecol (sustrato).

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Algunos reactivos con estructuras similares a la del sustrato

IV. MATERIALES Y REACTIVOS

Material de Prueba

Extractos enzimáticos de diferentes vegetales: Extractos enzimáticos de diferentes vegetales (papa sabanera, papa pastusa, ñame, batata y aguacate)

Preparación de extractos(este paso lo realiza el monitor por lo tanto no debe hacer diagrama): 3 g de material de prueba partido en pedazos pequeños, licuar con 50 ml de agua destilada. Renovarlo cada vez que se note pardeado.

Material por grupo de trabajo

Tubos de ensayo 15 Pinzas para tubo 2

Gradilla para tubos 2 Termómetro 1

Pipetas (1, 2, 5 ml) 3 Pipeteador 1

Vidrio de reloj 2

Pipeta graduada de (1, 5, 10 ml) 3 Goteros 2

Vaso de precipitado de 100 ml 1

Vaso de precipitados de 250 ml 1 Material adicional para todo

el grupo

Espátula 1

Papel indicador universal

Baños de maría

Bisturí

Reactivos

Extractos de vegetales

Resorcinol, 0.2%

Feniltiourea, 0.5%

CCl3COOH,10%(ácido tricloroacético)

Catecol, 0.2%

Fenol, 5%

Buffer de fosfatos o acetato 0.1M pH= 3; 5; 7 y 9

Hidroquinona, 0.2%

Acido cítrico (recién preparado), 5%

Hielo

V. PROCEDIMIENTO.

Verificación de la actividad enzimática

En tubos de ensayo marcados, limpios y secos, pipetee en orden las soluciones que se indican en el cuadro 1

CUADRO 1

TUBOS

REACTIVOS 1 2 3

Extracto enzimático (ml) 1 1 -

Catecol 0.2% (ml) 1 - 1

Agua destilada (ml) - 1 1

Mezcle bien y coloque los tubos en baño de maría a 37oC durante 25 minutos. Mezcle los tubos cada 5 minutos sin sacarlos del baño. Observe el color inicial y el final en cada uno de los tres ensayos. Cada grupo trabaja un extracto diferente a lo largo del laboratorio y solo en este primer ensayo la tabla de resultados recoge los datos de todos los grupos (extractos). En los siguientes ensayos solo se incluyen en la tabla los resultados de su grupo (extracto).

Si los colores no son definidos se puede emplear el siguiente código

No hay cambio de color _

Color claro +

Color oscuro ++

Color muy oscuro +++

Efecto de la temperatura

Tome 4 tubos de ensayo y mida en cada uno de ellos 1 ml del extracto enzimático. Coloque los tubos a diferentes temperaturas durante 10 minutos, así:

Tubo 1 a 0oC (en hielo)

Tubo 2 a 37oC (en baño de agua)

Tubo 3 a 60oC (en baño de agua)

Tubo 4 a 92oC (en agua hirviendo)

Al cabo de 10 minutos agregue a cada uno, 1 ml de catecol al 0,2%. Déjelos a la temperatura indicada por 5 minutos más. Observe los resultados y escriba en su informe los cambios de color presentados, según el código indicado anteriormente.

Por último, tome los tubos 1, 3 y 4 colóquelos en baño de agua a 37oC durante 10 minutos. Si observa algún cambio regístrelo y analícelo en el informe, postule una temperatura

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