Separar los pigmentos de una muestra vegetal, por medio de técnicas cromatográficas.

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LABORATORIO DE QUÍMICA ANALÍTICA E INSTRUMENTAL 502503

GUIA No 7 Principios de cromatografía

Cromatografía en capa delgada y en Columna (clásica) y HPLC

1. EL PROBLEMA.

Separar los pigmentos  de una muestra vegetal, por medio de técnicas cromatográficas.

Cuantificar la cantidad de etanol presente en una muestra de licor , usando HPLC

1. FUNDAMENTO TEORICO.

La historia de la cromatografía moderna se remonta a los estudios del botánico ruso Mikhail Tswett, quien utilizó una columna rellena de carbonato de calcio (fase estacionaria) para separar pigmentos coloreados de extractos vegetales. La muestra se colocaba en la parte superior de la columna y se hacia pasar a través del carbonato de calcio usando éter de petróleo (fase móvil). A medida que el solvente se desplazaba, los pigmentos se empezaban a separar  en bandas coloreadas, luego se sacaba de la columna el carbonato, se cortaba y cada pigmento se extraía por separado. Tswett denominó esta técnica cromatografía, por la combinación de las palabras griegas que significaban “color” y “escribir”. Después de 1931 esta técnica analítica tomo interés para las separaciones bioquímicas gracias a los  trabajos de Martín y Synge (1941), y por los cuales fueron merecedores del premio Nobel de Química en 1952.

En resumen, la cromatografía es una técnica en la que se separan solutos debido a la distribución diferencial de estos, entre la fase móvil y la estacionaria.

Las separaciones se pueden clasificar en tres formas:

• según el estado físico de la fase móvil y de la estacionaria
• según el método de contacto entre las fases
• según los mecanismos físicos o químicos responsables de la separación

La fase móvil suele ser un líquido o un gas (cromatografía líquida o cromatografía de gases) y la fase estacionaria es un sólido o una película líquida que reviste una superficie sólida. Para poner en contacto la fase móvil y la estacionaria se usan dos métodos, la cromatografía de columna (CC) donde la fase estacionaria se empaca en una columna estrecha por la cual pasa la fase móvil, por efecto de la gravedad o de una presión aplicada. La cromatografía de capa delgada (CCD), la fase sólida cubre una lámina plana de vidrio, metal o plástico, que se coloca en contacto con la fase móvil y esta se desplaza por capilaridad.

El mecanismo por el que los solutos se separan se pueden catalogar en cromatografía de adsorción y cromatografía de reparto; en la primera los solutos se separan según la capacidad para adsorberse sobre una fase estacionaria sólida, y en la segunda, la separación se debe a la diferencia del equilibrio de reparto (solubilidades) entre la fase móvil líquida y la fase estacionaria (película líquida). También la separación se puede deber a las interacciones electrostáticas entre la fase estacionaria y los solutos (cromatografía de intercambio iónico); por la interacción entre los solutos con las cavidades porosas de un gel (cromatografía de exclusión por tamaño), y por la formación de enlaces específicos entre la fase estacionaria y los solutos (cromatografía de afinidad).

1. MATERIALES Y REACTIVOS.

Cada grupo debe tener:

• Un mortero con mano
• Un vidrio de reloj
• Una espátula
• Dos Pipetas graduadas de 10 mL
• Dos erlenmeyer de 50,0mL
• Cuatro vasos de precipitados de 50 mL
• Un embudo de vidrio mediano
• Una pipeta Pasteur con chupa
• Una pipeta Pasteur sin chupa
• Un agitador de vidrio
• Una nuez
• Una pinza para refrigerante pequeña
• Dos goteros plásticos limpios y secos
• Un triangulo de porcelana
• Dos cortes de gasa
• Dos capilares
• Un tapón de caucho con hueco (para que se coloque la pipeta Pasteur)
•   1 Micriopipeta de 10 a 100µL
•   1 Micriopipeta de 100 a 1000µL

Material y reactivos de uso general:

• Etanol al  96%
• n-Hexano
• Eter de petróleo
• Tolueno:metanol (9:1)
• Acetona:metanol (9:1)
• Acetona:cloroformo:metanol (7:2:1)
• Etanol al 96%:agua (1:1)
• Etanol al 96%:agua (1:2)
• Placas de celulosa
• Placas de sílica gel
• Sílica gel en polvo
• Alúmina en polvo
• Lana de vidrio
• Parafilm
• Algodón
• Dos planchas de calentamiento
• Varilla metálica delgada (para empujar la lana de vidrio o el algodón al fondo de la pipeta Pasteur)
• Papel aluminio
• 5 vasos de precipitados de 250 mL. o 5 envases en vidrio transparente altos, con tapa.

Las muestras vegetales que se pueden utilizar son: Remolacha, mora, achiote.

Seco en la estufa de aire  durante la noche a 50oC

1. PROCEDIMIENTO

1. Preparación de la muestra-Extracción etanólica:

Pique el material vegetal seco en pequeños trozos y pese aproximadamente 10g de este, coloque la muestra en el mortero, adicione 10,0 mL de etanol al 96% y haga la extracción. Filtre sobre gasa y recoja el filtrado en un erlenmeyer de 50 mL, devuelva el residuo al mortero y repita la extracción dos veces más. Concentre el extracto etanólico en una plancha de calentamiento a temperatura moderada y en la campana de extracción hasta un volumen aproximado de 5 mL, tape con parafilm y guarde para la cromatografía. No deje secar el extracto. (Cuidado con calcinar el extracto).

El residuo sólido se utilizará para la extracción con solventes orgánicos.

1. Preparación de la muestra-Extracción con solvente orgánico:

El residuo sólido obtenido del punto anterior colóquelo nuevamente en el mortero seco y adicione 10,0 mL de n-hexano o de éter de petróleo y haga la extracción. Filtre sobre gasa y recoja el filtrado en un erlenemyer de 50,0 mL. realice la extracción dos veces más. Concentre el extracto orgánico en la plancha de calentamiento al baño maría, en la campana de extracción. Concentre hasta un volumen aproximado de 5 mL, tape y guarde para la cromatografía.

Puede desecha el residuo sólido.

1. Cromatografía en columna (CC): Para el extracto con solvente orgánico

En un vaso de precipitados de 50,0 mL adicione entre 3 y 5 gramos de la fase estacionaria que va a utilizar y luego adicione 10 mL del solvente o mezcla de solventes que usará como fase móvil. Agite suavemente.

Coloque en forma adecuada la pipeta Pasteur en una pinza para refrigerante, introduzca una pequeña  porción de lana de vidrio al interior para hacer un tapón no muy compacto ni muy alto al fondo de la pipeta. Adicione lentamente la suspensión de la fase estacionaria en el solvente de estudio con un gotero de vidrio y cuide que no se formen burbujas al interior de la columna; recoja en solvente que sale de la columna en un vaso de precipitados, parcialmente tapado con papel alumnio. Llene la columna con la fase estacionaria HASTA 0,5cm por debajo del nivel superior. No deje que la columna se seque, manténgala húmeda con el solvente que usará como fase móvil.

Coloque 2 a 5 gotas del extracto con el solvente orgánico en un vidrio de reloj y déjelo secar al medio ambiente o en baño maría, luego adicione 5 gotas de la fase móvil, disuelva los pigmentos y  coloque las cinco gotas en la parte superior de la columna sobre la fase estacionaria previamente despejada de fase móvil. Deje que los pigmentos se introduzcan en la columna y luego elúyalos adicionando más fase móvil a la columna hasta que se observe separación o un pigmento coloreados llegue al final de la fase estacionaria. No deje que los pigmentos se salgan de la columna, tapando la parte superior e inferior con Parafilm. Observe.

1. Cromatografía en capa delgada (CCD):

Trace una línea con lápiz, a 1 cm de altura, en la lámina con la fase estacionaria adecuada; divida la línea en dos y en la primera porción adicione con un capilar dos gotas del extracto correspondiente (ver tabla 1) y en la segunda porción 6 gotas del extracto, deje secar al aire. Coloque la placa en la cámara de revelado en donde está la fase móvil, y debe sumergirse por debajo del punto de siembra del extracto; la mezcla de solventes correrá sobre la lámina por capilaridad y se retirará la placa cuando la fase móvil esté a 1cm de llegar al nivel superior. Deje secar a la atmósfera y con un lápiz indique la posición de los pigmentos sobre la placa. Observe.

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