Separar los pigmentos de una muestra vegetal, por medio de técnicas cromatográficas.

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LABORATORIO DE QUÍMICA ANALÍTICA E INSTRUMENTAL 502503

GUIA No 7 Principios de cromatografía

Cromatografía en capa delgada y en Columna (clásica) y HPLC

1. EL PROBLEMA.

Separar los pigmentos  de una muestra vegetal, por medio de técnicas cromatográficas.

Cuantificar la cantidad de etanol presente en una muestra de licor , usando HPLC

1. FUNDAMENTO TEORICO.

La historia de la cromatografía moderna se remonta a los estudios del botánico ruso Mikhail Tswett, quien utilizó una columna rellena de carbonato de calcio (fase estacionaria) para separar pigmentos coloreados de extractos vegetales. La muestra se colocaba en la parte superior de la columna y se hacia pasar a través del carbonato de calcio usando éter de petróleo (fase móvil). A medida que el solvente se desplazaba, los pigmentos se empezaban a separar  en bandas coloreadas, luego se sacaba de la columna el carbonato, se cortaba y cada pigmento se extraía por separado. Tswett denominó esta técnica cromatografía, por la combinación de las palabras griegas que significaban “color” y “escribir”. Después de 1931 esta técnica analítica tomo interés para las separaciones bioquímicas gracias a los  trabajos de Martín y Synge (1941), y por los cuales fueron merecedores del premio Nobel de Química en 1952.

En resumen, la cromatografía es una técnica en la que se separan solutos debido a la distribución diferencial de estos, entre la fase móvil y la estacionaria.

Las separaciones se pueden clasificar en tres formas:

• según el estado físico de la fase móvil y de la estacionaria
• según el método de contacto entre las fases
• según los mecanismos físicos o químicos responsables de la separación

La fase móvil suele ser un líquido o un gas (cromatografía líquida o cromatografía de gases) y la fase estacionaria es un sólido o una película líquida que reviste una superficie sólida. Para poner en contacto la fase móvil y la estacionaria se usan dos métodos, la cromatografía de columna (CC) donde la fase estacionaria se empaca en una columna estrecha por la cual pasa la fase móvil, por efecto de la gravedad o de una presión aplicada. La cromatografía de capa delgada (CCD), la fase sólida cubre una lámina plana de vidrio, metal o plástico, que se coloca en contacto con la fase móvil y esta se desplaza por capilaridad.

El mecanismo por el que los solutos se separan se pueden catalogar en cromatografía de adsorción y cromatografía de reparto; en la primera los solutos se separan según la capacidad para adsorberse sobre una fase estacionaria sólida, y en la segunda, la separación se debe a la diferencia del equilibrio de reparto (solubilidades) entre la fase móvil líquida y la fase estacionaria (película líquida). También la separación se puede deber a las interacciones electrostáticas entre la fase estacionaria y los solutos (cromatografía de intercambio iónico); por la interacción entre los solutos con las cavidades porosas de un gel (cromatografía de exclusión por tamaño), y por la formación de enlaces específicos entre la fase estacionaria y los solutos (cromatografía de afinidad).

1. MATERIALES Y REACTIVOS.

Cada grupo debe tener:

• Un mortero con mano
• Un vidrio de reloj
• Una espátula
• Dos Pipetas graduadas de 10 mL
• Dos erlenmeyer de 50,0mL
• Cuatro vasos de precipitados de 50 mL
• Un embudo de vidrio mediano
• Una pipeta Pasteur con chupa
• Una pipeta Pasteur sin chupa
• Un agitador de vidrio
• Una nuez
• Una pinza para refrigerante pequeña
• Dos goteros plásticos limpios y secos
• Un triangulo de porcelana
• Dos cortes de gasa
• Dos capilares
• Un tapón de caucho con hueco (para que se coloque la pipeta Pasteur)
•   1 Micriopipeta de 10 a 100µL
•   1 Micriopipeta de 100 a 1000µL

Material y reactivos de uso general:

• Etanol al  96%
• n-Hexano
• Eter de petróleo
• Tolueno:metanol (9:1)
• Acetona:metanol (9:1)
• Acetona:cloroformo:metanol (7:2:1)
• Etanol al 96%:agua (1:1)
• Etanol al 96%:agua (1:2)
• Placas de celulosa
• Placas de sílica gel
• Sílica gel en polvo
• Alúmina en polvo
• Lana de vidrio
• Parafilm
• Algodón
• Dos planchas de calentamiento
• Varilla metálica delgada (para empujar la lana de vidrio o el algodón al fondo de la pipeta Pasteur)
• Papel aluminio
• 5 vasos de precipitados de 250 mL. o 5 envases en vidrio transparente altos, con tapa.

Las muestras vegetales que se pueden utilizar son: Remolacha, mora, achiote.

Seco en la estufa de aire  durante la noche a 50oC

1. PROCEDIMIENTO

1. Preparación de la muestra-Extracción etanólica:

Pique el material vegetal seco en pequeños trozos y pese aproximadamente 10g de este, coloque la muestra en el mortero, adicione 10,0 mL de etanol al 96% y haga la extracción. Filtre sobre gasa y recoja el filtrado en un erlenmeyer de 50 mL, devuelva el residuo al mortero y repita la extracción dos veces más. Concentre el extracto etanólico en una plancha de calentamiento a temperatura moderada y en la campana de extracción hasta un volumen aproximado de 5 mL, tape con parafilm y guarde para la cromatografía. No deje secar el extracto. (Cuidado con calcinar el extracto).

El residuo sólido se utilizará para la extracción con solventes orgánicos.

1. Preparación de la muestra-Extracción con solvente orgánico:

El residuo sólido obtenido del punto anterior colóquelo nuevamente en el mortero seco y adicione 10,0 mL de n-hexano o de éter de petróleo y haga la extracción. Filtre sobre gasa y recoja el filtrado en un erlenemyer de 50,0 mL. realice la extracción dos veces más. Concentre el extracto orgánico en la plancha de calentamiento al baño maría, en la campana de extracción. Concentre hasta un volumen aproximado de 5 mL, tape y guarde para la cromatografía.

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