APLICACIONES DEL PCR EN TIEMPO REAL

APLICACIONES DEL PCR EN TIEMPO REAL La emergente tecnología del PCR en tiempo real ha demostrado su versatilidad y utilidad en diversos campos de la investigación biomédica y el diagnóstico biomolecular, siendo la limitante la imaginación de investigadores y fabricantes de nuevos equipos, productos y servicios asociados a estas ramas del conocimiento. Entre los campos de acción que más recurren a esta tecnología se cuentan la virología, la microbiología clínica y la investigación biomédica, aunque existen otras como las industrias alimenticias y farmacéuticas que han hecho o harán uso de esta tecnología. En el presente capítulo se revisarán algunas de las aplicaciones actuales y las perspectivas futuras de la tecnología del RT PCR.

4.1 Virología

 El PCR en tiempo real ha sido extremadamente útil para el estudio de agentes virales asociados a enfermedades infecciosas y ha ayudado a clarificar en alguna medida los procesos infectivos de dichas enfermedades. La mayor parte de los ensayos que se encuentran en la literatura muestran un aumento en la frecuencia de detección de virus comparándolos con las técnicas tradicionales, lo cual ha hecho más atractivo el uso del RT PCR en muchas áreas de la virología. El RT PCR se ha hecho valioso en estudios generales de virología, desde la simple confirmación de la presencia o ausencia de virus de diferentes enfermedades, o del monitoreo de la actividad de genes específicos como resultado del crecimiento bajo condiciones manipuladas. También se puede seguir la entrada alterada o replicación de un virus causada por la modificación tejido-específica y permite comparar entre replicación viral y expresión de genes celulares. (Mackay et al., 2002). EL RT PCR ha mejorado la velocidad y el alcance de la medición de cepas virales y las diferencias entre títulos de pacientes que muestran diferentes síndromes debidos a Aplicaciones Rodríguez M & Rodríguez W 37 variaciones del mismo virus. (Furuta et al., 2001). También, los estudios epidemiológicos han avanzado ya que con la técnica de RT PCR se puede medir con precisión la cantidad de dos ácidos nucleicos blanco en una sola reacción. El uso de nuevas estrategias químicas ha permitido una mejor discriminación de múltiples genotipos virales en un solo recipiente y ha provisto una alternativa a los métodos de detección de virus basados en ensayos de morbilidad y mortalidad. El uso del RT PCR ha suministrado datos más profundos sobre el papel de algunos compuestos que tienen inhibición en la reacción de PCR como también ha dado luz sobre la eficiencia de diferentes métodos de extracción de ácidos nucleicos de un diverso tipo de muestras. Esta capacidad de utilizar templados de diversos tipos de muestras, llena un requerimiento importantísimo para un sistema ideal de detección, que es capaz de aplicar una tecnología sencilla en muchos campos. Esta flexibilidad se destaca por la detección de ácidos nucleicos virales, derivados en diferentes formas de plantas, animales, lodos urbanos, fluido cerebroespinal, cultivo de tejidos, células sanguíneas mononucleares, plasma, suero, saliva y orina. También, condiciones críticas como sarcoma, carcinoma, neoplastia cervical intraepitelial y desórdenes linfoproliferativos pueden ser fácilmente estudiados para investigar relaciones directas o indirectas con infecciones virales. También, el seguimiento de la carga viral por técnicas de RT PCR ha sido beneficioso para realizar seguimiento de pacientes a quienes se les han trasplantado órganos. Esta tecnología se está convirtiendo en una herramienta esencial en el aseguramiento de vectores de terapia génica viral antes de su uso en pruebas clínicas. Adicionalmente, el estudio de virus emergentes ha sido complementado con la técnica de RT PCR como herramienta para demostrar relaciones existentes entre secuencias virales únicas, señales clínicas y síntomas de cada paciente. La velocidad y flexibilidad del RT PCR también ha sido de utilidad para los intereses comerciales y ha sido usada para la detección de contaminación microbiana en preparaciones de reactivos producidos a gran escala en sistemas de expresión eucarióticos.

 4.2 Microbiología clínica

(Costa, J. 2004) Las aplicaciones del RT PCR en el campo de la microbiología clínica no difieren mucho de las que utilizan comúnmente las reacciones de PCR convencional. Entre ellas se Aplicaciones Rodríguez M & Rodríguez W 38 cuentan el diagnóstico etiológico, el control del tratamiento con antimicrobianos y la caracterización genética de agentes infecciosos. No obstante, es previsible que gracias a sus indudables ventajas y a la sencillez de su empleo, la RT PCR haya ido reemplazando a la PCR convencional y que su aplicación se extienda a un número cada vez mayor de agentes infecciosos, implementándose progresivamente en la rutina asistencial. Algunas empresas de diagnóstico (Roche Diagnostics, Artus, Abbott, Celera) han hecho ya una apuesta decidida por la nueva tecnología y tienen disponibles, o los tendrán en breve, kits para el diagnóstico de los agentes infecciosos de mayor interés comercial mediante sistemas de PCR a tiempo real (VIH, VHB, VHC, citomegalovirus). Sin embargo, hay muchas enfermedades infecciosas, con menor interés comercial, en las que el uso de métodos moleculares de diagnóstico aporta indudables ventajas. La PCR a tiempo real, combinada con los nuevos sistemas automáticos para la preparación de las muestras, ofrece una plataforma ideal para el desarrollo de una gran variedad de pruebas moleculares para la identificación o cuantificación de esos agentes infecciosos. Es el caso de muchos virus, (familia de los Herpesvirus, virus respiratorios, enterovirus, virus JC, virus BK, etc.) o de bacterias que no crecen en medios de cultivo como Tropheryma wippeli, o que crecen mal como Bordetella pertussis o Bartonella o muy lentamente como Mycobacterium tuberculosis. También, de micosis invasivas, especialmente por Aspergillus ssp. o de infecciones parasitarias como las ocasionadas por Toxoplasma gondii en líquido amniótico o en líquido cefalorraquídeo (LCR). Otro campo potencial de aplicación del RT PCR es en la identificación de organismos fácilmente cultivables, cuya detección rápida sea beneficiosa por algún motivo. Por ejemplo, la identificación de Streptococcus del grupo B (S. agalactiae) en frotis vaginales. La colonización del tracto genital de mujeres parturientas por este agente se relaciona con un mayor riesgo de infección neonatal grave. El tiempo necesario para el aislamiento de esta bacteria mediante cultivo es de 1-2 días, mientras que por PCR a tiempo real su identificación se puede llevar a cabo en 30 min. La reducción del tiempo de diagnóstico puede mejorar la prevención de esas infecciones en recién nacidos. En otros casos, como la sepsis, la supervivencia del enfermo puede depender de un diagnóstico precoz del agente causal que permita establecer el tratamiento antibiótico específico en etapas tempranas del proceso. Probablemente en pocos años se habrán optimizado protocolos de Aplicaciones Rodríguez M & Rodríguez W 39 PCR múltiple a tiempo real para la identificación de los 10 o 20 agentes más frecuentes de la sepsis en unas pocas horas. Lógicamente, la PCR a tiempo real no va a reemplazar al hemocultivo, porque la sepsis puede estar ocasionada por una variedad de microorganismos mucho más amplia, pero la demora en el tratamiento se podrá reducir en un número considerable de casos, lo que sin duda puede mejorar el pronóstico de este grave proceso. El éxito de un tratamiento no sólo se basa en un diagnóstico etiológico precoz, sino que en muchas ocasiones la determinación rápida de la sensibilidad del agente causal a los fármacos antimicrobianos puede ser determinante. La PCR a tiempo real proporciona métodos ágiles y sencillos para la identificación de mutaciones puntuales asociadas con resistencias a fármacos antimicrobianos. Por ejemplo, en apenas una hora se puede determinar la presencia en heces de enterococos resistentes a vancomicina, facilitando el control de la transmisión de este patógeno en los centros sanitarios. En los últimos años se han desarrollado métodos sencillos para la detección rápida de mutaciones asociadas con resistencias a meticilina en Staphylococcus aureus y a rifampicina y a isoniacida en Mycobacterium tuberculosis. También se han descrito procedimientos para la identificación de mutaciones asociadas con resistencia a agentes antivíricos, como la lamivudina en VHB. Hoy día ya están disponibles kits comerciales para algunas aplicaciones comentadas en este apartado y en el futuro irán apareciendo muchos otros. Incluso para las enfermedades infecciosas menos frecuentes están, o estarán disponibles, protocolos bien optimizados, sencillos y rápidos para que puedan ser implementados en la rutina asistencial. No obstante, hay que hacer hincapié en que esta potente metodología sólo será útil si los laboratorios de microbiología clínica participan en programas de control de calidad bien definidos por entes gubernamentales.

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