Actividad Enzimatica

Los principios de la termodinámica ayudan a predecir si una reacción ocurrirá o no, pero no indican nada acerca de la velocidad con que sucede la reacción misma. Las células regulan las reacciones químicas con enzimas, catalizadores proteínicos que aceleran la velocidad de las reacciones sin consumirse en éstas. Hay que tener en cuenta que las enzimas, al igual que cualquier catalizador, no pueden hacer que una reacción proceda en una dirección termodinámicamente desfavorable, o influir en la concentración final de reactivos y productos si la reacción llega al equilibrio. En general las enzimas funcionan mejor en algunas condiciones estrechamente reguladas, que se denominan óptimas, y comprenden temperatura, pH y concentración de sales adecuadas. Cualquier desviación respecto de estas condiciones tiene efecto adverso en la actividad enzimática. En la presente práctica observaremos la actividad enzimática de la catalasa, presente en los peroxisomas de células animales y vegetales. La catalasa actúa sobre el peróxido de hidrógeno (H2O2) y promueve la descomposición de esta sustancia tóxica para las células según la siguiente ecuación:

2 H2O2 2 H2O + O2

Estudiaremos el efecto de la temperatura, pH y concentración (de la enzima) sobre la actividad de la catalasa de hígado de pollo y de tomate. La actividad de la enzima será evidenciada por la formación de burbujas de O2 en el tubo de ensayo.

Materiales

 Hígado de pollo en trozos y triturado, colocados en vasos de teknoport de 2 onzas y mantenidos en una caja de teknoport con hielo para evitar la degradación de la catalasa  Tomate en trozos y triturado, colocados en vasos de teknoport de 2 onzas mantenidos en hielo  2 cucharitas por grupo de asa larga y adaptadas para la incorporación de los tejidos a los tubos de ensayo  12 tubos de ensayo 15 x 150 mm

 Plumón indeleble para marcar los tubos y pipetas de 5 mL  Pipetas graduadas de 5 mL (2 por grupo) con dispensador (1 por grupo)  Peróxido de hidrógeno  Agua destilada en un beaker pequeño  Hielo triturado mantenido en un vaso de teknoport grande, para mantener las muestras de tejido a 5ºC  NaOH 1N  HCl 1 N  2 Gradillas portatubos por grupo  Cocinilla eléctrica con agua en ebullición conteniendo un soporte de tubos de prueba ( 1 por aula)  1 Pinza de madera por grupo  1 termómetro que registre temperaturas de 5ºC por grupo  1 tubo de prueba de 5 mL para mantener el peróxido de hidrógeno a 5ºC (por grupo)  Papel toalla (1/2 rollo por aula)  Tiras de pH (3 tiras por grupo)

1. Procedimiento

Este experimento se hará en grupos de 3 ó 4 estudiantes.

a) Caracterización de la actividad de la catalasa:

1) Rotule adecuadamente los tubos de ensayo del 1 al 5 2) Agregue 1 mL de agua destilada al tubo # 1, será un control que no contendrá tejidos. 3) Según la tabla siguiente agregue a cada tubo la muestra de hígado o de tomate (entero o triturado según corresponda) en cantidad equivalente a 1 cm3, lo cual corresponde a 1 o 2 trocitos de hígado/tomate en el caso de las muestras enteras y a 1mL de los mismos en el caso de la muestra triturada. 4) Tenga presente que en el siguiente paso usted debe cuantificar la intensidad de la reacción enzimática. Para eso tendrá que evaluar la formación de burbujas. 5) El desprendimiento de burbujas se registrará según la escala mostrada a continuación:

0 = no hay reacción 1 = reacción lenta (burbujeo mínimo) 2 = reacción moderada (burbujeo abundante pero lento) 3 = reacción rápida (burbujeo abundante y rápido) 4 = reacción muy rápida (burbujeo muy abundante y muy rápido) 6) Organice su grupo, una persona debe colocar el sustrato (peróxido de hidrógeno), otra persona debe estar lista para realizar las cuantificaciones

(según las categorías definidas en el punto anterior), otras personas deben concentrarse en asignar la cuantificación de la reacción. 7) Agregue con la pipeta graduada conectada al dispensador (según lo indique la tabla) 3 mL de H2O2 a cada tubo, trabaje rápido para tratar de iniciar la reacción en todos los tubos en forma simultánea.

Anote sus resultados y observaciones para cada tubo.

¿Qué se libera por acción de la catalasa?

Compare la velocidad de reacción del tubo # 2 (hígado en trozos) con la del tubo # 4 que contiene hígado triturado. Si existe una diferencia explique cuál es la causa.

¿Existen diferencias entre las reacciones efectuadas con hígado y aquellas realizadas con tomate? Si existe una diferencia explique cuál es la causa.

b) Re-utilizando la enzima

1. Rotule un tubo con el # 6. 2. Utilice una pipeta nueva de 5 mL con el dispensador y tome una alícuota

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