Análisis de resultados. En base a los resultados obtenidos tras la experimentación es posible observar varias cuestiones que son importantes de resaltar

Análisis de resultados

En base a los resultados obtenidos tras la experimentación es posible observar varias cuestiones que son importantes de resaltar. En primera instancia el aislamiento de los cloroplastos se llevó a cabo exitosamente con una serie de técnicas muy sencillas: homogenización y centrifugado. La homogenización comenzó con la trituración de las hojas de espinaca en el mortero adicionando una solución buffer de fosfatos 0.02M pH 0.8 y una solución de NaCl 0.35M; el objetivo de esto era llevar a cabo la lisis (o ruptura traumática) de las células con el suficiente cuidado para liberar el orgánulo deseado intacto. Este procedimiento se realiza normalmente en la presencia de un tampón biológico de apropiado potencial osmótico y pH, en este caso la solución buffer de fosfatos y NaCl que contiene cloruro sódico, fosfato sódico, cloruro de potasio y fosfato de potasio, y cuya osmolaridad y concentración de iones (Cl-, Na+ y K+) es muy semejante a la del líquido extracelular. Su funcionamiento es muy sencillo pues los grupos fosfato mantienen el pH estable y por tanto la osmolaridad coincide con la del medio en el que se encuentra (principalmente medios isotónicos); por tanto se trata de una solución isotónica, es decir, que la concentración de soluto es igual dentro y fuera de la célula, además de que no es tóxica para las mismas y su pH es de 7.4 un valor prácticamente neutro que no altera las condiciones normales bajo las cuales trabajan las células. Posteriormente la separación de los cloroplastos se llevó a cabo mediante la centrifugación pues este método es muy efectivo para separar sólidos de líquidos de diferente densidad por medio de la fuerza giratoria aplicada por la centrífuga. El objetivo de la técnica se basa en separar sólidos insolubles (de partículas muy pequeñas difíciles de sedimentar) de un líquido. Para ello, se aplica un fuerte campo centrífugo, con lo cual las partículas tenderán a desplazarse a través del medio en el que se encuentren con la aceleración = velocidad angular2 x radio, por tanto los componentes más densos de la mezcla se desplazan fuera del eje de rotación de la centrífuga, mientras que los componentes menos densos de la mezcla se desplazan hacia el eje de rotación. Los orgánulos tienen diferente tamaño y por lo tanto sedimentan a distintas velocidades durante la centrifugación. También tienen diferente densidad específica y flotan a distintos niveles en un gradiente de densidad. La centrifugación diferencial permite obtener un fraccionamiento inicial del contenido citoplásmatico, que puede purificarse con más precisión mediante una centrifugación isopícnica o bien una segunda ronda de centrifugación diferencial. Así pues en la primera ronda se separan los componentes más pesados (como son células enteras, núcleos, membranas plasmáticas) colectados en el sedimento, por tanto en el sobrenadante se localizan los orgánulos más ligeros y su separación se logra con una segunda ronda de centrifugado a una velocidad mayor (como son mitocondrias, cloroplastos, lisosomas, peroxisomas, etc.).

Así pues una vez aislados los cloroplastos se llevó a cabo la demostración de su capacidad reductora, para ello se etiquetaron 6 tubos de ensayo en la secuencia A1, A2, B1, B2, C1, C2 en donde los tubos 1 los tubos blanco (que contenían 1 mL de agua destilada, 1 mL de aceite y 5 mL de solución de 2,6-diclorofenolindofenol 0.00005M) y los tubos 2 serían los tubos experimentales (que contenían 1 mL de solución de cloroplastos, 1 mL de aceite y 5 mL de solución de 2,6-diclorofenolindofenol 0.00005M). Posteriormente se sometieron a diferentes tratamientos, pues los tubos A1 y A2 se colocaron en un medio de oscuridad, los tubos B1 y B2 en un medio de luz artificial y los tubos C1 y C2 a luz solar; todos por un lapso de 20 minutos. De acuerdo a los resultados de la tabla 1 se observó que los tubos blanco no presentaron ningún cambio tras la exposición a los distintos medios, sin embargo los tubos experimentales si presentaron cambios notorios en su apariencia. Tanto los tubos que se expusieron a la luz solar (C1 y C2) como los tubos que se expusieron a luz artificial (B1 y B2) presentaron un cambio de color respecto a su estado inicial: de una coloración verdosa intensa pasaron a una tonalidad verde mucho más clara. Este proceso se fundamenta debido a la reacción de Hill (en honor a Robert Hill) que en 1937 demostró que los cloroplastos aislados producen oxígeno en ausencia de CO2. Este  descubrimiento fue uno de los primeros indicios de que la fuente de electrones en las reacciones de la fase clara de la fotosíntesis era el agua. En su sistema in vitro, Hill usó un aceptor artificial de electrones, un compuesto de color azul llamado DCPIP (2,6-diclorofenolindofenol). La ecuación general de la reacción de Hill se puede sintetizar como:                                                  

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