Biología Molecular II

Universidad de las Fuerzas Armadas “ESPE”

Biología Molecular II

Integrantes: Miguel Criollo

                           Carlos Aguirre

                    Kathya Vargas

NRC: 2439

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INTRODUCCIÓN:

Las mutaciones en Sec63 causan la “enfermedad poliquística del hígado” (PCLD) en los seres humanos, un trastorno progresivo que se caracteriza por la presencia de muchos (> 20) quistes por todo el hígado.  

Hígados poliquísticos pueden crecer hasta diez veces su tamaño normal, lo que resulta en la morbilidad del paciente significativo. Aunque unas pocas intervenciones terapéuticas están disponibles para desacelerar el crecimiento de quistes, sólo el trasplante de hígado puede cambiar el curso de la enfermedad. 

Aún no está claro cómo mutaciones en Sec63  causa quistes hepáticos.

Posibilidad es que la interrupción de Sec63 desencadena estrés en ER (produce cuando la capacidad de la ER para procesar proteínas nacientes o dañados está sobrecargado)  que contribuye a la fisiopatología de la PCLD.

Mielina: material lipoproteico constituye algunos sistemas de bicapas fosfolipídicas.

Se encuentra en sistema nervioso de vertebrados, formando  capa gruesa alrededor de axones neuronales y permite la transmisión de los impulsos nerviosos.

La mielina es color blanco, por lo que los axones mielinizados de las neuronas forman la llamada materia blanca.

Células gliales especializadas generan la vaina de mielina: oligodendrocitos en el sistema nervioso central (SNC) y las células de Schwann en el sistema nervioso periférico (SNP).

Los segmentos de mielina están separados por los nodos de Ranvier, que son regiones sin mielina de la membrana axonal que contiene una alta densidad de los canales de sodio dependientes de voltaje (NAV)

MATERIALES Y MÉTODOS:

• Para descubrir los genes necesarios para el desarrollo y organización de los axones mielinizados, se realizó un cribado genético en el pez cebra para identificar mutantes con alteraciones en el nodo de Ranvier.
• Para determinar si mutación en   causa la patología hepática en larvas de pez cebra, se analizó la ultraestructura de este órgano en 5 dpf y a las 8 dpf. [pic 2]
• Al igual que en la glía, a 5 dpf, se observó hinchazón y la fragmentación del RE, de nuevo indicativo de estrés ER . A las 8 dpf, los cambios fueron aún más evidente: la fragmentación y la hinchazón de la sala de emergencia con la acumulación de una matriz densa en el lumen del RE.

RESULTADOS:

Se examino la expresión de NaV a lo largo de las ramificaciones de los axones en todos los montajes de larvas tenidas. La mutacion, ST67, fue identifcado con defecto fuerte del NaV. La mutacion presentada tenia números morfológicamente anormales y reducidos canales de NaV de la línea lateral del nervio a los 5 días después de la fertilización. El Sec63 ST67mutación es letal; larvas mutantes deja de inflar sus vejigas y la mayoría no sobreviven más allá de 14 dpf.

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Posteriormente se examinó la ultraestructura de los nervio por microscopía electrónica de transmisión (TEM). En el día 3 dpf, etapa temprana de mielinizacion, la medida del axón y la mielinizacion fue similar en ST67 y el tipo salvaje PLLn. A los 5 días, existió menos número de axones en el ST67 que en el tipo salvaje. Los axones del ST67 fueron rodeados por un número de envolturas de mielina.

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Para probar la hipótesis de que la Sec63 ST67 mutación activa la UPR, se examinaron XBP-1 empalme, así como bip y chop los niveles de expresión en Sec63 ST67 mutantes. La forma empalmada UPR-específica de XBP-1 se reguló en Sec63 ST67 embriones y larvas en todos los puntos de tiempo examinados. Usando PCR (QRT-PCR), también encontró que el bip se sobrereguló en Sec63 ST67 mutantes a las 3 dpf y 5 dpf, y que la chop está sobreregulada positivamente en Sec63 ST67 mutantes a 5 dpf. En conjunto, estos datos muestran una regulación al alza de múltiples marcadores UPR en Sec63 ST67 mutantes, lo que sugiere que los niveles de estrés ER son elevados, como era de esperar en los mutantes con alteraciones en Sec63.

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Las mutaciones en Sec63 causa PCLD en los seres humanos, una, trastorno progresivo hereditario caracterizado por la presencia de numerosos quistes en todo el hígado. Curiosamente, una de las mutaciones causantes de la enfermedad en pacientes con PCLD afecta a un residuo de triptófano cerca de la lesión del ST67. Para determinar si el Sec63 ST67 mutación causa la patología hepática en larvas de pez cebra, se analizó la ultraestructura de este órgano en 5 dpf y a las 8 dpf. Al igual que en la glía, a 5 dpf, se observó hinchazón y la fragmentación de la ER, de nuevo indicativo de estrés ER.  A las 8 dpf, los cambios fueron aún más evidente: la fragmentación y la hinchazón  ER con la acumulación de una matriz densa en el lumen del RE. Fueron acompañados por regiones del citoplasma vacío, mitocondrias con una matriz densa y crestas más, así como perturbado y desorganizado canalículos biliares. Por último, observamos varias regiones del Sec63 ST67 hígados mutantes cargados de grandes lisosomas llenos de escombros y éstos fueron más frecuentes y prominentes a las 8 dpf que en 5 dpf. Este fenotipo se observó también en el intestino de los mutantes, pero nunca en los hermanos de tipo salvaje.

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