Bioquimica

Introducción

Todo ser vivo en la tierra requiere de ciertas condiciones para poder desarrollarse y así poder vivir. Si analizamos más a fondo, todos los organismos somos maquinas que funcionan utilizando lo que necesitamos para seguir funcionando y desechando lo que no nos sirve. Eso es básicamente el metabolismo. Gracias a él es que toda la vida se ha podido desarrollar a lo largo de nuestra corta vida en este universo. Pero el metabolismo tiene un componente fundamental que haría imposible su funcionamiento si no estuviese presente: las enzimas. Estas pequeñas máquinas son proteínas que tienen una función muy particular: catalizar las reacciones químicas. Significa que, algunas rutas metabólicas necesarias para vivir que no se producen estando a la deriva, pueden llevarse a cabo gracias a que está presente una enzima que toma un sustrato y da las condiciones para que se forme el producto. De esta forma es que la mayoría de las reacciones de los organismos son llevadas a cabo, utilizando enzimas catalizadoras. Pero estas, son específicas para cada reacción y bajo ciertas condiciones. Si alguna de estas falla, entonces la reacción no se llevará a cabo como se requiere.

En este práctico evaluaremos la actividad de la enzima β-galactosidasa, la que es capaz de hidrolizar β-galactosidos como la lactosa y el orto-nitrofenil-β-galactosido; analizaremos la velocidad a la que actúa y la influencia de la temperatura sobre esta reacción.

Método experimental

Experimento 1.1:

Para este trabajo práctico se realizó una curva de calibración de concentraciones de producto (ONF). Se realizó un protocolo que se muestra en la Tabla I y se utilizaron los compuestos señalados en la guía de estudios y con esas concentraciones.

Tabla I: Protocolo para curva de calibración.

Tubo [ONF] (µM) ONF (mL) Agua (mL) Carbonato de Na (mL) Amortiguador (mL) Total (mL)

1 0,00 0,00 2,20 0,3 0,5 3

2 0,02 0,12 2,08 0,3 0,5 3

3 0,10 0,60 1,60 0,3 0,5 3

4 0,15 0,90 1,30 0,3 0,5 3

5 0,20 1,20 1,00 0,3 0,5 3

6 0,30 1,80 0,40 0,3 0,5 3

En la segunda parte del experimento se realizó un protocolo de incubación que puede observarse en la Tabla II a modo de control. De ésta forma podemos asegurarnos que tanto nuestra enzima como nuestro sustrato se encuentran en las condiciones óptimas. Se utilizó un tiempo de incubación de 10 minutos a una temperatura de 30ºC.

Tabla II: Protocolo para incubación.

Compuestos Orden Incubación Blanco sustrato Blanco enzima

Agua [mL] 1º 0,5 0,7 0,8

Amortiguador [mL] 2º 0,5 0,5 0,5

Β-galactosidasa [mL] 3º 0,3 0,3 -

ONFG [mL] 4º 0,2 - 0,2

Total [mL] 1,5 1,5 1,5

Experimento 1.2:

Se dispuso de 10 tubos de ensayo para 10 tiempos de incubación diferentes. Se utilizaron los mismos componentes de la incubación de la tabla II para todos los tubos siendo la enzima la última en ser agregada. Se agregó 0,3mL de Carbonato de Na a los tubos en los tiempos establecidos para detener la reacción. La incubación se realizó a 30ºC.

Datos

Luego de realizado el experimento 1.1 con ayuda del protocolo de la tabla I se midieron las absorbancias de los 6 tubos a 420nm y los resultados se ven a continuación en la Tabla III.

Tabla III: Absorbancias de las distintas concentraciones de ONF.

Tubo Abs420nm

1 0,003

2 0,053

3 0,239

4 0,363

5 0,480

6 0,661

A los 3 tubos utilizados en la primera incubación se les agregó 1,2mL de agua para completar los 3 mL y se midieron absorbancias. Se realizó el mismo procedimiento con los tubos del experimento 1.2 para la curva de progreso. Todo esto puede verse en las Tablas IV y V.

Tabla IV: Absorbancias de la incubación.

Tubo Abs420nm

a 0,399 Incubación

b 0,003 Blanco sustrato

c 0,003 Blanco enzima

Tabla V: Absorbancias para la curva de progreso.

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