Conteo De Bacterias

INTRODUCCION.

Existen varios métodos para cuantificar poblaciones de bacterias y microorganismos en general. Todos estos métodos tienen un fundamento particular y puede haber desde métodos directos hasta indirectos. En los primeros como su nombre lo indica, la cuantificación de los microorganismos se realiza en forma directa, generalmente se emplean hematocímetros o cámaras diseñadas inicialmente para contar células sanguíneas como las cámaras de Neubauer y las de Petroff-Hauser; también podemos hacer uso de técnicas de recuento en placa de superficie o bien de profundidad , las cuales a partir de un número determinado y observable de colonias de bacterias formadas en la placa nos permite obtener el número de unidades formadoras de colonias. En este tipo de cuantificaciones se pueden emplear medios selectivos para facilitar la identificación de los microorganismos a cuantificar.

Por otra parte los métodos indirectos de cuantificación de microorganismos se basan en la medida de algún parámetro del cultivo que nos permite deducir información sobre la evolución del número de microorganismo como lo son la producción de sustancias propias del metabolismo de las bacterias u hongos, la turbidez producida en un tubo de ensayo, entre otras.

Usualmente se requiere preparar suspensiones de las muestras y diluirlas para una eficiente cuantificación, como se hizo durante el desarrollo de la práctica experimental. El presente informe muestra los resultados en términos de unidades formadoras de colonias del conteo de bacterias por medio del método de recuento en placa en superficie y en profundidad.

OBJETIVOS.

• Conocer el fundamento de las técnicas más utilizadas para el recuento microbiano.

• Establecer cuantificación de microorganismos a partir de una muestra de suelo, mediante el método de recuento en placa en superficie y en profundidad.

MATERIALES Y EQUIPOS.

• Muestra de suelo.

• Erlenmeyer con diluyente (solución salina 0.82% o agua peptonada 0.1 % esterilizada.)

• Placas de medio: cajas de petri con PCA.

• Gradillas con tubos de ensayo con 4,5 ml de solución salina esterilizada.

• Varillas de vidrio en L o espátulas de Drigalsky.

• Balón con agar nutritivo fundido.

• Frasco con desinfectante.

• Cajas de petri.

• Pipetas de 0.5, 1 o 2 ml esterilizadas.

• Vortex.

PROCEDIMIENTO.

1. Preparación de diluciones y siembra en superficie.

Inicialmente, se marcaron las cajas de petri con el medio PCA desde 10-2 hasta 10-6, del mismo modo se marcaron los tubos de ensayos con los diluyentes. Seguidamente se pesaron 10 gr de suelo los cuales se adicionaron a 90 ml de diluyente con agitación constante. Luego, sé transfirió 1ml de la disolución al tubo marcado con 10-2, de éste se tomó 1ml de la disolución y se transfirió al tubo marcado con 10-3 y así sucesivamente hasta el tubo marcado como 10-6 (ver figura 1). Con la última pipeta empleada se procedió a verter alícuotas de 0.1 ml de disoluciones en las placas pero en orden inverso, es decir desde 10-6 hasta 10-2, para luego hacer extensiones de la muestra sobre la placa con ayuda de la espátula. Finalmente, se prosiguió a incubar con las cajas invertidas a 37° C durante 24 horas y a realizarlos cálculos correspondientes a el número de unidades formadoras de colonias por gramos de suelo.

Figura 1. Diluciones efectuadas.

2. Recuento en placa con siembra en fondo (técnica de vertido en placa).

A partir de las diluciones contenidas en los tubos de ensayos del procedimiento anterior se procedió a agregar a partir de la dilución 10-6, 1ml de la misma a la una caja marcada con 10-6 y luego se vertieron aproximadamente 12 ml del medio temperado, homogenizando cuidadosamente la muestra, luego una vez gelificado el medio se procedió a incubar a 37° durante 24 horas; finalmente se seleccionaron las placas que tenían entre 30 a 300 colonias haciéndose el registro de las mismas en términos de unidades formadoras de colonias.

RESULTADOS Y DATOS.

Método de recuento en placa en superficie.

Datos:

-Factor de dilución: 10-6

Numero de colonias: 187

Ml de la muestra: 0.1.

Calculo del número de unidades formadoras de colonias por gramos de suelo.

Ufc= # colonias x 1/ fac.de dilución x 1/ml de muestra.

Ufc= 187 x 1/10-6x 0.1

Ufc=187 x10e7 / gr de suelo= 1.87x10e 10 ufc/gr de suelo.

Factor de dilución: 10-5

Numero de colonias: 228

Ml de la muestra: 0.1.

Calculo del número de unidades formadoras de colonias por gramos de suelo.

Ufc= # colonias x 1/ fac.de dilución x 1/ml de muestra.

Ufc=228 x 1/10-5x 0.1

Ufc=228 x10e6 / gr de suelo= 2.28x10e 8ufc/gr de suelo.

Obs: para el resto de diluciones se hizo imposible contar las colonias debido a que la cantidad de microorganismos estaba más concentrada, quedando de manifiesto la gran utilidad de efectuar diluciones.

Método de recuento en placa en siembra en fondo.

Calculo del número de unidades formadoras de colonias para la dilución 10-6.

Ufc= # de colonias x 1/factor de dilución.

Ufc= 223 x 10e6.

Ufc=2220000000.

ANALISIS.

Es muy importante para un investigador vinculado a la microbiología reportar en sus informes el número y la talla promedio de una población de bacterias en una muestra estudiada. En el campo de la alimentación y la higiene es esencial conocer la carga microbiana de aguas, alimentos, superficies de trabajo. Etc., de esta manera podemos determinar la repercusión sanitaria o la calidad de los productos analizados.

Para este fin se emplean diversas técnicas de conteo de microorganismos que si bien no fueron empleadas en el laboratorio durante el desarrollo de esta práctica experimental no dejan de ser importantes, por tal razón y a manera de análisis se citan a continuación cada una de ellas con una breve cita de su fundamento:

1-Las técnicas de recuento microscópico de células sin fijar usando microscopía de contraste de fase. Para ello se

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