Departamento de biología y química, facultad de educación y ciencias, universidad de sucre.

 PROTEINA LISOZIMA C

Departamento de biología y química, facultad de educación y ciencias, universidad de sucre.

Bioquímica l

Yan c. Ozuna Díaz

INTRODUCCION  

A lo largo de la historia se han venido ejerciendo métodos de predicción de proteínas, los cuales han ido avanzando, como por ejemplo, los métodos iniciales para la predicción de estructuras secundarias fueron introducidos en la década de los 60 y los 70 del siglo XX, los cuales se centraron en la identificación de posibles hélices alfa y se basaron, principalmente, en modelos de transición de hélice-ovillo. En los 70 se introdujeron métodos más precisos que incluían hojas beta, estos métodos, aplicados a una única secuencia, tienen como mucho una precisión de 60-65%, aunque a menudo no predicen correctamente las hojas beta. A medida que pasa el tiempo estos métodos van evolucionando gracias al aprendizaje automático y se han creado unos métodos más precisos, tales como las redes neuronales o las máquinas de soporte vectorial, estas últimas fueron creadas por Vladimir Vapnik y su equipo de laboratorios AT&T; entre otros métodos específicos actuales. Las proteínas se consideran el motor de la vida, ya que están implicadas en todas las acciones celulares necesarias para la vida. Existen un total de 20 aminoácidos que son las unidades elementales que componen las proteínas. Por eso Conocer la forma que adopta una proteína nos ayuda a saber más acerca de su función y sus implicaciones en los mecanismos reguladores de la vida. La lisozima, también conocida como muramidasa (Nacetil muramidaglicano hidrolasa, E. C. 3. 2.1. 17), Fue descubierta en 1922 por Alexander Fleming. Es la primera proteína de la que se dispuso de su secuencia por cristalografía de rayos-X, además la primera enzima de la que se determinó su mecanismo enzimático gracias a David Phillis en 1966.  La lisozima se encuentra en muchos organismos como virus, insectos, anfibios, reptiles, aves y mamíferos, produciéndose en multitud de tejidos y fluidos, incluyendo Huevos de aves, leche humana, lagrimas, saliva y es además secretada por leucocitos polimorfo nucleares1, 2, 3,4.

Como objetivo, básicamente se quiso analizar la estructura secundaria de la proteína lisozima c y para ello, de igual forma se estudiaron ciertas características necesarias y relevantes del mismo; para lo cual se procedió bajo la utilización del programa para predicción de proteínas conocido como Protein Data Bank, el cual se ingresó el código (1HEL) de la proteína a analizar y este permitió la inmediata proyección de datos en cuanto a secuencias de aminoácidos y por ende el modelo estructural de la proteína; Dichas secuencias de aminoácidos y modelo estructural en 3D también se pudieron determinar en los servidores swiss model y PredictProtein.

MATERIALES Y METODOS  

Se realizó Predicción de la secuencia de aminoácidos y estructura secundaria de la lisozima c a través de dos servidores web, como swiss model y PredictProtein. Comparamos los resultados con la estructura reportada en el protein databank y Verificamos su eficiencia.

Purificación (protein databank)

Se mezcló una gota de 10 μl con 20 mg / ml de proteína (Lisozima de huevo) en acetato de sodio 200 mM y pH 4,4, con 5 μl de la solución del depósito (cloruro sódico al 4,0% p/ v), y se dejó reposar sobre la solución del depósito a temperatura ambiente. Algunas variantes requerían concentraciones de cloruro de sodio ligeramente superiores para lograr cristales de calidad de datos. Generalmente aparecieron de uno a tres cristales en cada gota. Los cristales son isomorfos con la forma utilizada por Phillips y e-workers para la determinación inicial de la estructura. Para la recopilación de datos cristalográfico se realizó una resolución de los datos de rayos X de cada una de las variantes y también datos de la lisozima de la clara de huevo de pollo. Asimismo, permitió un control de las coordenadas refinadas para la enzima de pollo y permitió que todas las variantes se refinaran de manera consistente. En cada caso, se utilizaron las estructuras cristalinas refinadas y se ignoraron los posibles efectos sobre el estado desplegado.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

Secuencia de aminoácidos

La secuencia de aminoácidos de la proteína lisozima c obtenida en PDB es la siguiente:

KVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAAKFESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSRWWCNDGRTPGSRNLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSDGNGMNAWVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRL

La estructura primaria de la lisozima C, es decir su secuencia de aminoácidos, está compuesta por 129 aminoácidos  los cuales poseen un peso molecular entre 14 y 30 KDa. La estructura primaria posee estabilidad a través de 4 puentes disulfuro, los puentes disulfuro contienen la totalidad de las cisteínas que se encuentran en la molécula, es decir, las ocho cisteínas. Dos de estos puentes se encuentran en la región alfa (Cys 6 - Cys 27 y Cys 30 - Cys 115); otro puente disulfuro se encuentra en el dominio beta (Cys 64 – Cys 80) mientras que el otro puente (Cys 76 – 94) está entre los dos dominios (alfa y beta) 12.

[pic 2]

Figura#1: se observa un esquema de algunas de las características estructurales que presenta el servidor web protein databank. (Onda roja: hélices; flecha azul: hebras; enlaces celeste: puente disulfuro; arco amarillo: giros)

[pic 3]

Figura#2: En la parte izquierda de la imagen se observa  la proteína original y en la parte derecha de color azul la proteína modelo, arrojada por el servidor web SWISS-MODEL. Donde sí nos detenemos  a mirar los círculos amarillos de las dos proteínas vemos que  no concuerda en la proteína original ya que en el modelo se ve una región con una lámina beta rodeada por giros, y en la proteína original es un giro rodeado por una hélice alfa. Así mismo donde se encuentran ubicados los círculos rojos se determinó que la proteína modelo, arrojada por el servidor no concuerda con la proteína original ya que se ve una región donde deducimos que es una hélice alfa en la proteína a la que se le realizo la predicción. En cambio, en la original es un giro.

El modelo arrojado por SWISS-MODEL mostró una parte diferente de la proteína original Reportada en el PDB, la cual está comprendida entre los residuos del 1 al 3 y del 128 al 129. Ya que se encontraron zonas que en la proteína original constituyen giros y en el modelo son constituyentes laminas plegadas y hélices así como se observa en la imagen 2.

La estructura secundaria de la lisozima C está compuesta en su mayoría por hélices alfa, las cuales tienen aproximadamente unos 6 residuos por vuelta y cada uno de estos, un giro de 100° en la hélice, las hélices alfa de la lisozima C son más estables en la sección central que en los extremos, esto se debe a que los aminoácidos que se encuentran en los extremos pueden formar sólo un enlace de hidrógeno, mientras que los aminoácidos de la zona central pueden formar dos. Las alfa hélices en la lisozima conforman el sitio activo de esta. En cuanto a las láminas beta de esta proteína son antiparalelas, lo cual quiere decir que unas se dirigen del grupo amino al carboxilo, mientras las otras se dirigen del grupo carboxilo al grupo amino; en el caso de la lisozima una de las tres hebras que conforman la lámina beta. La estructura secundaria de la lisozima C está compuesta en su mayoría por hélices alfa, las cuales tienen aproximadamente unos 6 residuos por vuelta y cada uno de estos, un giro de 100° en la hélice, las hélices alfa de la lisozima C son más estables en la sección central que en los extremos, esto se debe a que los aminoácidos que se encuentran en los extremos pueden formar sólo un enlace de hidrógeno, mientras que los aminoácidos de la zona central pueden formar dos. Las alfa hélices en la lisozima conforman el sitio activo de esta. En cuanto a las láminas beta de esta proteína son antiparalelas, lo cual quiere decir que unas se dirigen del grupo amino al carboxilo, mientras las otras se dirigen del grupo carboxilo al grupo amino; en el caso de la lisozima una de las tres hebras que conforman la lámina beta12.

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